旱地小麥區試品系中抗旱高產相關基因的KASP 標記檢測

摘要：利用分子標記檢測小麥區試品系，明確其優異等位基因組成，有利于進一步精準改良利用。分析KASP標記檢測中存在的問題，有助于促進分子育種應用。以山東省2021—2022 年小麥旱地區試24 份參試品系為材料，利用32 個抗旱高產相關基因的KASP 標記，分析KASP 標記檢測中存在的異常結果和材料的優異等位基因利用情況。結果表明，未知基因型產生的主要原因是KASP 反應失敗或非特異擴增。混合DNA 樣品檢測結果為雜合的主要原因是單株間基因型不一致，次要原因是錯誤分型。32 個KASP 標記中，14 個標記的優異等位基因檢出率超過83%，表明這些基因在育種中已經得到有效利用；17 個標記的優異等位基因檢出率低于50%，其中，WRKY51-2B、AX-95025477-7B、SnRK2.4A3、TaMoc-2433 和NCED1 5 個標記的優異等位基因未檢出，表明這些基因在育種中利用較少，可通過分子標記輔助選擇開展遺傳改良。24 份材料中，HQ04 攜帶20 個優異等位基因，是數量最多的，可作為基因供體用于育種。利用KASP 標記開展輔助選擇定向精準提高優異等位基因在小麥育種中的利用率仍有可為。

關鍵詞：小麥；抗旱；功能基因；KASP 標記；區試品系

中圖分類號：S512.1 文獻標識碼：A 文章編號：1002?2481（2024）04?0009?07

長期以來干旱是導致小麥減產的重要因素之一，制約著小麥產量水平的提高。河北省和山西省是水資源缺乏重災區，河北省先后選育出節水高產品種石家莊8 號[1]、高產優質品種石優20[2]等，山西省選育出了晉麥47[3]、晉麥101[4]等節水小麥品種。實踐證明，通過選育和推廣抗旱節水小麥新品種是干旱半干旱地區提高小麥產量和品質的重要途徑。山東是小麥生產大省，據山東統計年鑒數據，近幾年山東小麥播種面積在400 萬hm2 左右，居全國第2 位；其中旱地小麥約占1/3，而產量不足1/4[5]。山東省先后育成了魯麥21[6]、山農27[7]等抗旱小麥品種。近年來，山東省農業科學院作物研究所先后選育了濟麥262[8]、濟麥60[9]、濟麥379[10]等抗旱新品種，為山東旱地小麥生產作出重要貢獻。培育抗旱節水小麥新品種是抵御干旱、保障旱地小麥高產穩產的根本途徑。傳統抗旱育種以常規雜交為主，通過水旱交叉選擇實現豐產性和抗旱性兼顧。隨著現代生物技術的發展，現代生物育種正在從傳統育種向精準設計育種轉變，通過分子標記輔助選擇可以實現優異等位基因的快速精準選擇。

KASP（Kompetitive allele specific PCR）標記是LGC 公司開發的一種檢測SNP 的技術方法，被廣泛用于各種作物的分子標記檢測。RASHEED等[11]在小麥中開發和驗證了70 個KASP 標記，其中包括2 個抗旱相關標記，是較早報道的小麥抗旱KASP 標記。KHALID 等[12]報道了另外3 個與抗旱適應性相關的KASP 標記，使抗旱相關標記增加到5 個。UR REHMAN 等[13]進一步開發了11 個抗旱相關KASP 標記，使可用標記的數量進一步增加。李瑋等[14]新報道了與抗旱、抗寒、根系等相關的11 個KASP 標記，豐富了KASP 標記關聯的抗旱相關性狀種類。越來越多小麥抗旱相關KASP 標記的開發為開展抗旱分子標記輔助選擇育種提供了便利。

小麥旱地區試的參試品系代表了小麥抗旱育種的水平，新的抗旱品種將從此脫穎而出，然而，目前對抗旱品種（系）攜帶優異等位基因分布情況的報道較少。本研究以2021—2022 年山東省小麥旱地區試的參試品系為材料，選擇與抗旱高產性狀遺傳位點相關的32 個KASP 標記進行檢測，分析參試品系攜帶優異等位基因數量，旨在了解小麥抗旱等相關優異等位基因利用情況，以促進利用KASP標記進行抗旱小麥遺傳改良。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試的23 份2021—2022 年山東省小麥旱地區試參試品系（HQ01-HQ23）和對照品種山農27（表1），均取自德州市農業科學研究院試驗基地。

1.2 DNA 提取

返青期取小麥單株葉片長度2 cm 左右，每個編號隨機選取長勢一致的3 個單株，采用簡化高鹽低pH 值法[15]分別提取DNA，調整質量濃度至100 ng/μL，相同編號的3 個單株DNA 等量混合后進行檢測。

1.3 KASP 標記檢測

32 個KASP 標記9 個和根系相關，21 個和抗旱相關，2 個和抗寒相關。KASP 反應體系和反應程序均參考RASHEED 等[11]的報道，所用32 個KASP標記見表2。

引物序列詳見參考文獻，由北京擎科生物科技有限公司青島分公司合成（表2）。KASP MasterMix 購自LGC 公司。使用PHERAstar 檢測，檢測結果導入Kluster Caller 軟件分型。對于檢測結果中出現的未知和雜合基因型，用3 個單株DNA 重新檢測，以確定雜合基因型產生的原因。

2 結果與分析

2.1 KASP 標記未知和雜合基因型分析

用24 個混合DNA 樣品檢測時，KASP 標記分型圖中產生了Hex 基因型（紅色圓點）、Fam 基因型（藍色圓點）、雜合基因型（綠色圓點）、未知基因型（粉色圓點），黑色圓點為無模板對照（圖1）。

圖1-A 顯示的是P5CS1A 基因分型情況，其中，HQ03 在該位點的基因型未知，HQ10、HQ12 和HQ21 為雜合基因型。為了明確這些未知基因型和雜合基因型產生的原因，隨即各用3 個單株進行了驗證，結果如圖1-a 所示，HQ03 的3 個單株DNA檢測結果全部為Hex 基因型，說明混樣中未知基因型產生的原因之一是KASP 反應失敗；而HQ10 的檢測結果為1 個Hex 基因型和2 個Fam 基因型，HQ12 的檢測結果為2 個Hex 基因型和1 個Fam 基因型，HQ21 的檢測結果為1 個Hex 基因型和2 個Fam 基因型，說明不同純合基因型單株的采樣是造成混樣呈現雜合基因型的主要原因。

共7 個標記（8 個數據點）的混合DNA 樣本中存在未知基因型，進一步的單株檢測發現，AX-95025477-7B 標記在HQ06 種質的3 個單株DNA仍為未知基因型，其余均成功分型為Hex 或Fam 基因型，表明未知基因型產生的主要原因是KASP 反應失敗，重新檢測可以成功分型。共18 個標記（25 個數據點，圖1-B）在混合DNA 樣本中存在雜合基因型，進一步的單株檢測結果發現，17 個數據點表現為2 種純合基因型，比如HQ10 的TaSnRK2.3-1B-KASP-4 標記3 個單株檢測結果分別為Fam、Hex、Hex（圖1-b）；1 個數據點表現為Hex、Fam 和雜合3 種基因型，剩余7 個數據點的單株DNA 檢測結果一致，為假雜合。以上結果表明，混合DNA 樣品檢測結果為雜合的主要原因是單株間基因型不一致，占本研究中全部雜合基因型的72%，次要原因是錯誤分型，占比為28%。

在排除假雜合后共有6 個品系單株檢測的基因型不一致，其中，HQ04、HQ10 和HQ12 分別有4、4、7 個標記位點不一致，表明這3 個品系雜合度可能偏高，但不排除取到混雜單株的可能。而HQ16、HQ21 和HQCK 僅有1 個標記位點不一致，可能該位點未純合。在后續分析中雜合基因型用單株檢測占多數的基因型替代，HQ04 的TaSnRK2.3-1BKASP-4 標記單株檢測結果有Hex、Fam 和雜合3 種基因型，在優異等位基因分析時按含有優異等位基因處理，HQ06 的AX-95025477-7B 標記單株檢測結果仍為未知基因型，在優異等位基因分析時按非優異等位基因處理。

2.2 32 個KASP 標記的檢測結果

檢測結果表明（圖2），14 個標記的優異等位基因檢出率較高（gt;80%），包括TaSnRK2.8-5AKASP-7、TaPPH-KASP-13、TaDreb_SNP、VSR1-2BMITE、DRO5A、TaSAP-7B-KASP-8、TaLTPs-KASP-11、PYL1B、DRO5B、TaPARG-2A-KASP-9、Wcor142B、TaLTPs-KASP-12、1fehw3 和SnRK2.4B3；標記P5CS1A 的優異等位基因檢出率接近50%；12 個標記的優異等位基因檢出率較低（lt;21%），攜帶這些優異等位基因的品系可作為供體親本，包括攜帶WRKY51-2A 優異等位基因的品系HQ04 和HQ14，攜帶AX109558906-6B 優異等位基因的品系HQ04 和HQ06，攜帶TaSnRK2.3-1AKASP-2 優異等位基因的品系HQ12 和HQ18，攜帶TaSnRK2.3-1B-KASP-4 優異等位基因的品系HQ07、HQ15、HQ17，攜帶SRL14A929和SRL14A96優異等位基因的品系HQ05、HQ18、HQ20，攜帶TaS?nRK2.9-5A-KASP-6 和TaSnRK2.9-5A-KASP-5優異等位基因的品系HQ05、HQ12、HQ16、HQ22，攜帶OSCA1.4 優異等位基因的品系HQ07、HQ15、HQ17，攜帶DTG2BK2 優異等位基因的品系HQ12，攜帶TaGW2-6A 優異等位基因的品系有5 個，包括HQ02、HQ04、HQ07、HQ17 和HQ19，攜帶COBL5B 優異等位基因的品系也有5 個，包括HQ02、HQ04、HQ07、HQ12 和HQ15。5 個標記的優異等位基因未檢出，包括WRKY51-2B、AX-95025477-7B、SnRK2.4A3、TaMoc-2433、NCED1。整體來看，32 個標記對應基因位點在區試材料里優異等位基因的利用程度呈兩極分化趨勢，43.75%基因位點的優異等位基因利用較多，另外，56.25%基因位點的優異等位基因利用較少，特別是優異等位基因未檢出的5 個基因位點有待加強利用。

從參試品系分析，24 份材料攜帶優異等位基因數量11～20 個不等，區試對照品種HQCK 的優異等位基因數量為14 個，全部為高檢出率的優異位點。利用優異等位基因最多的HQ04 為20 個，除14 個高檢出率的優異位點還包括TaGW2-6A、COBL5B、P5CS1A、WRKY51-2A、AX109558906-6B 和TaSnRK2.3-1B-KASP-4。利用優異等位基因數量最少的品系HQ06 為11 個，缺少了高檢出率優異位點TaPPH-KASP-13、TaDreb_SNP、DRO5A、TaSAP-7B-KASP-8 和DRO5B，但增加了AX109558906-6B 和P5CS1A。特別注意，攜帶優異等位基因多的品系可在育種中多加利用，如HQ07、HQ17可能是良種。

3 結論與討論

KASP 技術自開發以來，因其檢測簡單快速，通量靈活等優點，已被廣泛應用于水稻[18]、玉米[19]等多種作物的分子標記輔助選擇等研究。RASHEED等[11]較早將KASP 技術應用在小麥中，在其檢測結果中有32 個標記存在未知基因型，7 個標記存在雜合基因型。ZHAO 等[20]利用KASP 標記分析了1 152 份全球小麥47 個基因的優異等位基因利用情況，在其檢測結果中46 個標記有未知基因型，42 個標記有雜合基因型存在。ZHANG 等[21]利用44 個基因的KASP 標記分析了207 份小麥，結果顯示，41 個標記存在未知基因型，26 個標記存在雜合基因型。李瑋等[22]在對區試品系混合DNA 樣品進行KASP 標記檢測時，發現雜合基因型比例較高，可能與混合取樣有關。以上結果表明，在進行KASP 標記檢測時未知基因型和雜合基因型普遍存在。當未知基因型和雜合基因型個數較多時就需要加以關注。本研究利用32 個KASP 標記對24 份小麥混合DNA 的分析結果中，共有7 個標記存在未知基因型，用單株DNA 重新檢測后僅剩1 個標記存在未知基因型。一般來說，未知基因型產生的原因主要包括引物結合位點變異，DNA 質量較差和KASP 反應失敗，故進一步對未知基因型樣品單株DNA 重新檢測后成功分型，說明本研究前一步未知基因型的出現是由于KSAP 反應失敗，但是個別樣品重復檢測仍無法分型，可能和引物結合位點存在變異有關。本研究為了分析混合DNA 樣品檢測時25 個數據點（18 個標記）的雜合基因型產生原因，用單株DNA 進行了驗證，結果表明，18 個數據點是由于單株基因型不一致導致，另外7 個數據點是錯誤分型導致的假雜合。單株間基因型不一致的原因可能與品系不純和種子混雜有關，為了避免混合取樣造成的雜合，可以考慮進行單株取樣并盡量排除可能的雜株。對于非特異擴增導致的錯誤分型，可通過提高引物的特異性和優化反應條件來改善。

選育小麥抗旱品種是一項長期而艱巨的工作，隨著抗旱相關功能基因的克隆，利用分子標記輔助選擇進行抗旱基因聚合可以有效提高抗旱育種的效率。RUBAB 等[23]通過KASP 功能標記檢測和表型性狀鑒定篩選出了抗旱性較好的親本材料，為抗旱育種提供了參考。ELTAHER等[24]分析了TaDreb-B1和1-FEH w3 等位基因在冬小麥和春小麥群體中與抗旱的關聯性，認為TaDreb-B1 抗旱等位基因與抗旱表型的一致性比1-FEH w3 更好。本研究結果表明，14 個標記的優異等位基因在育種中已經得到選擇利用，另外17 個標記的優異等位基因檢出率較低，對這些基因的利用需要加強，特別是WRKY51-2B、AX-95025477-7B、SnRK2.4A3、TaMoc-2433、NCED1 5 個標記的優異等位基因未檢出，因為標記是共顯性，未檢出和引物無關，表明本研究中的24 份小麥未利用這5 個基因。攜帶WRKY51-2B 優異等位基因的品種有晉麥47、晉麥92、晉麥101 等[14]，攜帶AX-95025477-7B 優異等位基因的品種有中麥895、輪選987、魯麥15 等[25]，攜帶SnRK2.4A3 優異等位基因的品種有濟麥379等[14]，攜帶TaMoc-2433 優異等位基因的品種有魯麥1、中國春等[13]，攜帶NCED1 優異等位基因的品種有和尚頭、臨旱2 號和德抗961 等[17]，其可作為今后育種利用的目標親本加以關注。在檢測的32 個KASP 標記中，區試對照品種山農27 攜帶其中14 個優異等位基因，而區試品系攜帶優異等位基因的數量為11～20 個不等，通過分子標記輔助選擇聚合更多的優異等位基因來選育抗旱品種仍有可為。HQ04 在檢測品系中攜帶優異等位基因最多，可作為親本加以利用。值得注意的是隨著目標基因數量的增多，雜交組合方式將變得復雜，所需的群體大小也呈指數增加，需要對基因組合方式進行取舍。目前，抗旱品種選育仍然以傳統表型選擇為主，盡管幾乎沒有通過對抗旱基因選擇育成品種的報道，但從本研究的結果中可以看出，大部分優異位點仍然在高代品系中被利用。如果能將分子標記輔助選擇和傳統育種相結合，有望通過對抗旱基因的定向精準選擇提升選擇效率。

本研究通過對24份小麥旱地區試品系進行32個KASP 標記檢測，發現14 個標記的優異等位基因在24 份參試品系中有20 份檢測結果為陽性，檢出率超過83%；另外，18 個標記的優異等位基因檢出率低于50%，其中，WRKY51-2B、AX-95025477-7B、SnRK2.4A3、TaMoc-433 和NCED1 5 個標記的優異等位基因未檢出，明確了抗旱相關優異等位基因在區試品系中的利用情況，為利用KASP 標記開展定向精準分子育種提供了參考。

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基金項目：山東省農業良種工程項目（2021LZGC009，2022LZGCQY002，2021LZGC013）；山東省農業科學院創新工程項目（CXGC2023A01）