鹽酸雙嗎啡肽對耐藥食管癌細胞遷移和侵襲能力的影響

［摘要］"目的"探討骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）小分子抑制劑鹽酸雙嗎啡肽（Dorsomorphin）對耐藥食管癌EC109/PTX細胞遷移和侵襲能力的影響。

方法"MTT實驗檢測不同濃度鹽酸雙嗎啡肽對EC109/PTX細胞增殖的影響并確定后續(xù)實驗的濃度。以篩選出的1 μmol/L鹽酸雙嗎啡肽的濃度作為試驗組，同時設立空白對照組，處理EC109/PTX細胞48 h。采用流式細胞儀檢測鹽酸雙嗎啡肽對EC109/PTX細胞凋亡的影響。采用劃痕實驗和Transwell實驗檢測兩組EC109/PTX細胞的遷移和侵襲能力。采用Western blotting實驗檢測兩組EC109/PTX細胞中Vimentin、E-cadherin、N-cadherin蛋白相對表達水平。

結(jié)果"1 μmol/L鹽酸雙嗎啡肽對EC109/PTX細胞的細胞抑制率為（9.89±1.12）%。培養(yǎng)第48小時時，對照組和實驗組EC109/PTX細胞的凋亡率比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。劃痕實驗和Transwell實驗顯示，與對照組相比，實驗組EC109/PTX細胞的遷移率和細胞穿膜率顯著降低（t=85.42、19.65，Plt;0.05）。Western blotting實驗顯示，與對照組相比，實驗組細胞中Vimentin、N-cadherin蛋白相對表達量顯著降低（t=19.40、41.79，Plt;0.05），N-cadherin蛋白表達量顯著增高（t=58.12，Plt;0.05）。

結(jié)論

BMP抑制劑鹽酸雙嗎啡肽能影響耐藥食管癌細胞中EMT相關蛋白表達，從而抑制耐藥腫瘤細胞的遷移和侵襲。

［關鍵詞］"骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)4；Dorsomorphin；抗藥性，腫瘤；食管腫瘤；細胞運動；腫瘤浸潤；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；基因表達調(diào)控，腫瘤

［中圖分類號］"R735.1;R394

［文獻標志碼］"A

Effect of dorsomorphin on the migration and invasion abilities of drug-resistant esophageal cancer cells

SHI Xiaoli， SU Zhiguo， ZHANG Ying， YANG Guoshuai， PENG Wennuan， WANG Chen， MA Lin

（Department of Pharmacy， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266700， China）

［ABSTRACT］Objective To investigate the effect of dorsomorphin， a bone morphogenetic protein （BMP） small-molecule inhibitor， on the migration and invasion abilities of drug-resistant esophageal cancer EC109/PTX cells.

Methods MTT assay was used to observe the effect of different concentrations of dorsomorphin on the proliferation of EC109/PTX cells and determine the concentration for subsequent experiments. Dorsomorphin at the concentration of 1 μmol/L was established as the experimental group， and a blank control group was set up. EC109/PTX cells were treated for 48 h. Flow cytometry was used to observe the effect of dorsomorphin on the apoptosis of EC109/PTX cells; scratch assay and Transwell assay were used to observe the migration and invasion abilities of EC109/PTX cells; Western blotting was used to measure the relative protein expression levels of Vimentin， E-cadherin， and N-cadherin in EC109/PTX cells.

Results Dorsomorphin at the concentration of 1 μmol/L showed an inhibition rate of （9.89±1.12）% on the proliferation of EC109/PTX cells. At 48 h of culture， there was no significant difference in the apoptosis rate of EC109/PTX cells between the control group and the experimental group （Pgt;0.05）. Scratch assay and Transwell assay showed that compared with the control group， the experimental group had significant reductions in the migration rate and cell permeation rate of EC109/PTX cells （t=85.42，19.65，Plt;0.05）. Western blotting showed that compared with the control group， the experimental group had significant reductions in the relative protein expression levels of Vimentin and N-cadherin （t=19.40，41.79，Plt;0.05） and a significant increase in the protein expression level of N-cadherin （t=58.12，Plt;0.05）.

Conclusion The BMP inhibitor dorsomorphin can inhibit the migration and invasion abilities of drug-resistant tumor cells by affecting the expression of epithelial-mesenchymal transition-related proteins in drug-resistant esophageal cancer cells.

［KEY WORDS］ Bone morphogenetic protein 4; Dorsomorphin; Drug resistance， neoplasm; Esophageal neoplasms; Cell movement; Neoplasm invasiveness; Epithelial-mesenchymal transition; Gene expression regulation， neoplastic

鹽酸雙嗎啡肽（Dorsomorphin）是2001年通過高通量篩選出的一種小分子AMPK抑制劑，最初命名為化合物C［1］。實驗表明鹽酸雙嗎啡肽是骨形成蛋白4（BMP4）的Ⅰ型受體阻斷劑，通過阻斷BMP介導的SMAD1/5/8磷酸化，抑制成骨分化［2］。實驗證實鹽酸雙嗎啡肽可通過抑制跨膜蛋白ABCG2對化療藥物轉(zhuǎn)運，降低結(jié)直腸癌多藥耐藥性［3］。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是一種可逆的細胞去分化過程，是細胞通過一系列事件（如細胞連接丟失、細胞骨架重排和細胞外基質(zhì)重塑）獲得侵襲性間充質(zhì)能力的過程［4-5］，EMT可以促進腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移性擴散［6-7］。EMT在腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥等方面起關鍵的作用。本研究旨在探討鹽酸雙嗎啡肽對EMT相關蛋白表達的作用，探討鹽酸雙嗎啡肽對耐藥食管癌EC109/PTX細胞的遷移和侵襲能力的影響，為臨床耐藥食管癌轉(zhuǎn)移治療提供新思路。

1"材料與方法

1.1"材料及主要試劑

耐藥食管癌EC109/PTX細胞株由鄭州大學藥物研究院王淙課題組建株并提供，鹽酸雙嗎啡肽（美國selleck公司），RPMI1640培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司），胰蛋白酶（上海碧云天生物技術有限公司），凋亡試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司），Vimentin、E-cadherin、N-cadherin（美國CST公司）。

1.2"細胞培養(yǎng)

將耐藥食管癌EC109/PTX細胞置于完全培養(yǎng)基（每500 mL 的1640培養(yǎng)基中加入50 mL胎牛血清）中，于含體積分數(shù)0.05 CO2、37 ℃加濕的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。隔天更換一次新鮮完全培養(yǎng)基，待細胞處于對數(shù)生長期時用于后續(xù)實驗。

1.3"MTT實驗檢測鹽酸雙嗎啡肽對于細胞增殖的影響

將處于對數(shù)生長期的EC109/PTX細胞均勻接種于96孔板中，每孔約3×103個細胞。細胞過夜貼壁后，棄去原完全培養(yǎng)基，分別加入濃度0、0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L的鹽酸雙嗎啡肽完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。然后每孔加入濃度500 μg/ mL的MTT 20 μL，37 ℃下恒溫培養(yǎng)4 h后，棄去原培養(yǎng)液，每孔再加入150 μL DMSO。96孔板置于搖床上振蕩10 min后，使用酶標儀測定570 nm波長處細胞的吸光度（A）值。計算細胞的細胞抑制率。細胞抑制率（%）=（A對照－A實驗）/（A對照－A空白）×100%。繪制鹽酸雙嗎啡肽對EC109/PTX細胞的細胞抑制率曲線，計算細胞抑制率10%時鹽酸雙嗎啡肽的濃度，并再次通過MTT實驗檢測該濃度時細胞的抑制率。

1.4"流式細胞儀檢測鹽酸雙嗎啡肽對細胞凋亡的影響

取處于對數(shù)生長期的EC109/PTX細胞均勻接種于6孔板中，每孔約1×106個細胞，待細胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，實驗組中每孔加入含有1 μmol/L鹽酸雙嗎啡肽的完全培養(yǎng)基，對照組加入不含鹽酸雙嗎啡肽的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，使用無EDTA的胰酶消化細胞，PBS清洗后收集細胞。每組細胞當中依次加入Annexin V-FITC 188 μL， Mito-Tracker Red CMXRos染色液2 μL， Annexin V-FITC 5 μL，避光染色15 min后。采用BD LSRFortessaTM流式細胞儀檢測細胞的凋亡情況。

1.5"細胞劃痕實驗檢測鹽酸雙嗎啡肽對細胞遷移的影響

取處于對數(shù)生長期的EC109/PTX細胞接種至6孔板中，每孔約1×106個細胞，當細胞增殖密度達90%時進行劃痕。在實驗組中加入含1 μmol/L鹽酸雙嗎啡肽的完全培養(yǎng)基，對照組加入不含鹽酸雙嗎啡肽的完全培養(yǎng)基，兩組繼續(xù)培養(yǎng)48 h，兩組分別于劃痕后第0、48小時時使用熒光顯微鏡觀察并拍照。應用Image J軟件計算劃痕面積，結(jié)果取３次重復實驗的均值。

1.6"Transwell實驗檢測鹽酸雙嗎啡肽對細胞侵襲能力的影響

取直徑100 mm的培養(yǎng)皿中培養(yǎng)至對數(shù)生長期的EC109/PTX細胞，使用胰蛋白酶消化、PBS清洗后，在無血清的1640培養(yǎng)基中重懸并稀釋細胞，使每200 μL 1640培養(yǎng)基中含3×103個EC109/PTX細胞，隨機分為實驗組和對照組。在實驗組中加入1 μmol/L鹽酸雙嗎啡肽，對照組加入等體積的無血清1640培養(yǎng)基。在Transwell板中每個下室加入600 μL 含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，每孔上室加入200 μL細胞懸液。Transwell板置于恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，棄去原培養(yǎng)基，每孔加入4%多聚甲醛1 mL，固定細胞20 min后，每孔加入1%結(jié)晶紫1 mL，染色30 min后，PBS清洗多余染液。室溫下晾干，尼康顯微鏡拍照，Image J軟件統(tǒng)計細胞個數(shù)。

1.7"Western blotting實驗檢測細胞中EMT相關蛋白的表達情況

取對數(shù)生長期的EC109/PTX細胞，接種于直徑100 mm的培養(yǎng)皿中，待細胞密度約達40%時，棄去原完全培養(yǎng)基；在實驗組中加入含1 μmol/L鹽酸雙嗎啡肽的完全培養(yǎng)基，對照組加入完全培養(yǎng)基，再繼續(xù)培養(yǎng)48 h。棄去原完全培養(yǎng)基，PBS清洗細胞，胰蛋白酶消化貼壁細胞，收集的細胞使用RIPA蛋白裂解液裂解后，以BCA蛋白定量試劑盒定量，根據(jù)測定樣品的濃度和體積，加入相應體積的6×Loading Buffer，將樣品放置于100 ℃水浴鍋中，高溫變性5 min，混勻后上樣或放置冰箱－20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｏ葘⒅甘镜鞍追肿恿康念A染蛋白Marker上樣，再將實驗組和對照組的樣品上樣，在SDS-PAGE膠中以70 V、22 mA恒流條件下進行電泳30 min，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜1.5 h，將NC膜夾入5%脫脂牛奶中室溫封閉1.5 h。一抗4 ℃下孵育12 h，二抗室溫下孵育2 h后ECL顯影。實驗結(jié)果采用Image J軟件進行灰度分析，以計算目的蛋白的相對表達量。

1.8"統(tǒng)計學處理

使用Graph Pad 6.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有實驗步驟均獨立重復3次，結(jié)果以±s表示，兩組間比較采用t檢驗。以Plt;0.0５為差異具有統(tǒng)計學意義。

2"結(jié)""果

2.1"鹽酸雙嗎啡肽對于EC109/PTX細胞活性的影響

以濃度0、0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L鹽酸雙嗎啡肽處理EC109/PTX細胞48 h后，細胞抑制率分別為（0.02±0.21）%、（2.91±

1.75）%、（7.34±2.34）%、（9.12±2.65）%、（13.13±4.62）%、（18.16±4.78）%、（21.13±3.96）%、（23.08±1.76）%、（23.72±3.68）%、（45.52±4.53）%、（92.56±0.31）%。繪制鹽酸雙嗎啡肽對EC109/PTX細胞的細胞抑制率曲線，通過該曲線計算出細胞抑制率10%時，鹽酸雙嗎啡肽濃度為1 μmol/L。再次MTT實驗結(jié)果顯示，1 μmol/L鹽酸雙嗎啡肽作用EC109/PTX細胞48 h時細胞抑制率為（9.89±1.12）%。因此以濃度為1 μmol/L的鹽酸雙嗎啡肽用于后續(xù)實驗。

2.2"鹽酸雙嗎啡肽對于EC109/PTX細胞凋亡的影響

在培養(yǎng)至第48小時時，實驗組以及對照組細胞的細胞凋亡率分別為（6.32±0.39）%、（5.37±0.14）%，兩組間比較差異無顯著性（Pgt;0.05）。

2.3"鹽酸雙嗎啡肽對EC109/PTX細胞遷移能力的影響

在培養(yǎng)第48小時時，實驗組和對照組EC109/PTX細胞的細胞遷移率分別為（55.35±0.07）%、（24.57±0.11）%，兩組間比較差異有顯著性（t=85.42，Plt;0.05），見圖1。

2.4"鹽酸雙嗎啡肽對EC109/PTX細胞侵襲能力

的影響

在培養(yǎng)至第48小時時，實驗組以及對照組的EC109/PTX細胞的細胞穿膜率分別為（100.20±10.53）%、（48.02±5.38）%，兩組間比較差異有顯著性（t=19.65，Plt;0.05）。見圖2。

2.5"鹽酸雙嗎啡肽對EC109/PTX細胞中EMT家族相關蛋白表達的影響

在培養(yǎng)第48小時時，與對照組相比，實驗組細胞中Vimentin、N-cadherin蛋白相對表達量顯著降低（t=19.40、41.79，Plt;0.05），N-cadherin蛋白相對表達量增高（t=58.12，Plt;0.05）。見圖3、表1。

3"討""論

食管癌是世界第五大常見的消化系統(tǒng)腫瘤，包括鱗癌和腺癌兩類［10］。臨床針對食管癌患者的治療方案主要包括放療和化療，化療藥物主要包括紫杉醇、多柔比星、氟尿嘧啶等［11］。化療過程易產(chǎn)生毒副作用，并且長時間的化療易使腫瘤產(chǎn)生耐藥，為后續(xù)的臨床治療增加了難度。耐藥食管癌EC109/PTX細胞株是將食管癌EC109細胞間歇性暴露于高濃度的紫杉醇中獲得的［12］，是研究食管癌耐藥及其耐藥機制的常用細胞株。

BMP屬于轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）超家族，在細胞增殖和軟骨分化中具有廣泛的生物學作用［13］。在人類發(fā)育過程中，作為一種分泌蛋白，BMP通過與受體偶聯(lián)發(fā)揮功能，進而參與調(diào)節(jié)細胞的遷移與侵襲。BMP4是屬于TGF-β超家族的一員，與早期胚胎發(fā)育和腫瘤發(fā)生相關［14］。有研究表明，BMP4過表達可以增強乳腺癌細胞的化療耐藥性［15］。也有研究發(fā)現(xiàn)BMP4在胃癌組織中過表達，并且與患者的預后不良相關［16］。此外有實驗證實BMP4在順鉑耐藥的胃癌和卵巢癌細胞系中高表達。

BMP是參與胚胎骨骼形成的一類蛋白質(zhì)，其可能有助于維持腫瘤干細胞群體的細胞表型［17-18］。EMT是上皮細胞獲得間充質(zhì)特征的過程，EMT與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性相關［7，19］。有研究表明，美洲蒲公英的粗提取物作為BMP抑制劑，在體外可抑制三陰性乳腺癌細胞的增殖、EMT、侵襲和遷移［20-21］。也有研究顯示，BMP抑制劑鹽酸雙嗎啡肽能夠使人腦膠質(zhì)瘤細胞獲得上皮樣性狀，包括上調(diào)E-cadherin的表達，下調(diào)Snail和Slug轉(zhuǎn)錄因子的表達，以及喪失其干細胞特征和自我更新能力，這種表型轉(zhuǎn)換抑制了人腦膠質(zhì)瘤細胞的遷移、侵襲以及體外腫瘤的增殖［17］。以上研究表明，BMP是腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲的重要分子。研究顯示，食管癌EC109細胞耐藥后具有更強的侵襲和遷移能力［9］，因此本研究選擇了侵襲和遷移能力較強的耐紫杉醇的食管癌細胞EC109/PTX細胞株，探究BMP4抑制劑對EC109/PTX細胞株侵襲和遷移能力的影響。

參考相關研究，藥物在10%抑制濃度時通常被認為是無細胞毒性的［22-23］，因此本研究首先通過鹽酸雙嗎啡肽對EC109/PTX細胞的細胞抑制率曲線，計算細胞抑制率10%時鹽酸雙嗎啡肽濃度。再通過細胞凋亡實驗證實，濃度為1 μmol/L的鹽酸雙嗎啡肽在作用EC109/PTX細胞48 h時，并無明顯誘導細胞凋亡的作用，因此采用1 μmol/L濃度的鹽酸雙嗎啡肽用于后續(xù)實驗。

有研究顯示，鹽酸雙嗎啡肽能上調(diào)促凋亡家族成員Bad的表達，并參與促進慢性髓性白血病細胞K562的凋亡［24-25］。鹽酸雙嗎啡肽促進癌細胞凋亡可能與鹽酸雙嗎啡肽的劑量和腫瘤類型及分期相關。本研究中，與對照組相比，1 μmol/L鹽酸雙嗎啡肽可顯著抑制EC109/PTX細胞遷移能力，并顯著減少EC109/PTX細胞穿過半透膜的細胞數(shù)量，提示1 μmol/L鹽酸雙嗎啡肽具有抑制EC109/PTX細胞侵襲的能力。有研究顯示，鹽酸雙嗎啡肽可通過抑制法尼醇X受體過表達，進而抑制膀胱癌遷移、侵襲［26-27］。本研究又進一步對細胞中侵襲和遷移相關蛋白表達情況進行了檢測，以進一步揭示其作用的分子機制。結(jié)果顯示，1 μmol/L鹽酸雙嗎啡肽可以降低Vimentin、N-cadherin蛋白表達，同時升高N-cadherin蛋白表達。表明1 μmol/L鹽酸雙嗎啡肽可能通過影響EMT家族相關蛋白表達，進而抑制EC109/PTX細胞侵襲和遷移能力。

綜上所述，本研究檢測到BMP小分子抑制劑鹽酸雙嗎啡肽對耐藥食管癌細胞EC109/PTX的遷移和侵襲具有抑制作用；對EC109/PTX細胞遷移和侵襲能力的影響或與其下調(diào)Vimentin和N-cadherin的表達，上調(diào)E-cadherin的表達相關。鹽酸雙嗎啡肽對耐藥食管癌細胞遷移和侵襲能力的影響及分子機制仍需進一步研究和探索，以求為臨床上控制與預防食管癌侵襲和遷移提供理論支持。

作者聲明：石曉麗、彭溫暖、馬霖參與了研究設計；石曉麗、蘇治國、楊國帥、張英、王晨參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文，且均聲明不存在利益沖突。

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（本文編輯"耿波）