赤霉酸GA4+7產生菌的誘變選育研究

摘要：將GA4+7產生菌制備菌絲懸液和原生質體懸液，用紫外照射疊加氯化鋰誘變的方法進行迭代誘變，誘變處理后的菌液涂布平板，通過搖瓶培養篩選平板上的單菌落，最后得到一株突變菌GX34-4，相比出發菌株GA4+7，GX34-4的搖瓶效價提高約25%，50 L發酵罐效價提高約40%。與出發菌株的外觀和效價不穩定性相比，突變株GX34-4遺傳穩定性較好，連續傳代5次，產量無明顯降低，在50 L發酵罐上亦表現穩定。

關鍵詞：原生質體；紫外線；氯化鋰；迭代誘變

中圖分類號：R978 " " " "文獻標志碼：A

Study on mutagenesis and breeding of GA4+7 producing strain

Xu Xu， Zuo Jianying， and Xiong Renke

（Sichuan Lomon Bio-technolog Co.， Ltd..， Meishan 620000）

Abstract The GA4+7-producing strain was used to prepare mycelium suspension and protoplast suspension， and the iterative mutagenesis was carried out by ultraviolet irradiation and lithium chloride mutagenesis. The mutagenesis-treated bacterial solution was coated on a plate， and the single colonies on the plate were screened by shaking bottle culture. Finally， strain GX34-4 was obtained. Compared to the starting strain GA4+7， the titer of GX34-4 in the shake flask was increased by about 25%， and the titer in the 50 L fermenter was increased by about 40%. The appearance and titer of the starting strain were unstable. The genetic stability of mutant GX34-4 was good， and the yield of mutant GX34-4 was not significantly reduced after five successive generations. which was also stable in a 50 L fermenter.

Key words Protoplast; Ultraviolet irradiation; Lithium chloride; Iterative mutagenesis

赤霉酸（gibberellin acid， GA）是一種廣譜生長調節劑，為四萜二環類化合物，可促進作物生長發育、種子發芽、提高果實結果率或形成無籽果實，其種類繁多，目前已發現的赤霉菌有100多種，統稱為赤霉素類，活性較高的如：GA1、GA3、GA4、GA7，其中GA3和GA4+7最具有使用和商業價值[1]，GA4和GA7因性質相似、分離純化困難，常以其混合物即GA4+7存在，GA7主要產生在莖尖及未成熟的種子中，GA4在植物的根、莖、葉及種子中都有發現。在促進植物莖生長的活性上，赤霉素表現為GA3＞GA7＞GA4[2]，市場上的赤霉酸類調節劑多以GA3為主，GA7會強烈抑制花芽的形成，而GA4對花芽的形成不僅不會抑制反而具有促進作用，GA4+7混合使用活性適中，可以起到優勢互補的作用，同時，GA4+7可打破休眠且不會引發胚軸的生長，開花效果良好，座果率高，能提高水果表皮角質層的韌性，預防褐斑病[3]。

我國關于GA4+7方面的研究較少，且其生產成本高，價格貴，本文主要通過對赤霉素GA4+7產生菌GZ19進行迭代復合誘變和選育，獲得產量提高且穩定的GA4+7突變型菌株，并在后續50 L發酵罐實驗中取得了良好的效果。

1 材料與方法

1.1 菌種與培養基

1.1.1 菌種

藤倉赤霉菌本公司貯存。

1.1.2 培養基

（1）斜面/平板培養基：PDA培養基。

（2）菌絲生長培養基：甘氨酸、蔗糖、乙酸銨等[4]。

（3）再生培養基：PDA培養基加一定量的NaCl。

（4）高滲緩沖液：蒸餾水配制0.7 mol/L Nacl溶液，滅菌備用[4]。

（5）種子/種子罐培養基；淀粉、大豆餅粉、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂等。

（6）發酵/發酵罐培養基：淀粉、大豆餅粉、花生餅粉、葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸銨等。

1.2 幼嫩菌絲懸液的制備和原生質體懸液的制備

1.2.1 " "菌絲培養

將斜面菌絲接種菌絲生長培養基，30 ℃，200 r/min

培養約24 h，點種鋪有微孔濾膜的菌絲生長培養基，30 ℃培養24～48 h，至濾膜上可見薄層菌絲。

1.2.2 " "幼嫩菌絲懸液的制備

參見“1.2.1”進行菌絲培養，用滅菌生理鹽水洗下濾膜上的菌絲，高速勻漿分散，得到幼嫩菌絲懸液。

1.2.3 " "原生質體懸液的制備

參見“1.2.1”進行菌絲培養，用過濾除菌后的復合酶液（纖維素酶和蝸牛酶用高滲溶液按一定比例組成）洗下，置30 ℃酶解3～4 h，用高滲溶液終止酶解，G2漏斗過濾除去未酶解的菌絲，得到原生質體懸液[5]。

1.3 菌絲和原生質體的復合誘變

1.3.1 紫外誘變

下列操作均在紅光下進行，紫外燈預熱20 min，待光波穩定后，將菌絲懸液或原生質體懸液放入盛有無菌轉子的平皿中，開蓋邊攪拌邊照射一定時間（20 W，距離20 cm），稀釋涂布PDA培養基或再生培養基，以誘變前的菌落數做對照，用活菌計數法計算致死率。

1.3.2 氯化鋰誘變

將菌絲懸液或原生質體懸液加入不同濃度的氯化鋰處理一定時間后，以大量稀釋法終止反應，稀釋涂布PDA培養基或再生培養基，以誘變前的菌落數做對照，用活菌計數法計算致死率。

1.3.3 紫外+氯化鋰復合誘變

根據單因素實驗的結果，適當降低處理濃度和處理時間，以誘變前的菌落數做對照，用活菌計數法計算致死率。致死率=1-誘變前的單菌落數/誘變后的單菌落數×100%

1.3.4 迭代誘變

第一次復合誘變用GZ19的菌絲懸液作為出發菌，將篩選出的高產菌株作為第二次復合誘變的出發菌株，用同樣的方法選擇合適的誘變劑量，處理出發菌株的原生質體，再次篩選更高產的菌株。

1.4 突變株初篩和復篩

突變株初篩直接將再生平板上生長出來的單菌落挖塊接種到發酵培養基中，33 ℃，200 r/min培養

7 d，放瓶檢測效價。

復篩將單菌落挖塊接種到種子培養基中，30 ℃，

200 r/min培養3 d，再以10%的接種量接種到發酵培養基中，33 ℃，200 r/min培養7 d，放瓶檢測效價。

1.5 高產菌株的穩定性實驗

將搖瓶篩選出來的高產菌株在PDA平板上進行連續傳代，從F1代至F5代，每代平板進行搖瓶發酵培養，檢測效價。

1.6 效價測定

用HPLC檢測GA4和GA7含量。

2 結果與討論

2.1 原生質體懸液條件的選擇

采用含甘氨酸的培養基培養菌絲，可完全消除液體培養基對后續酶解的影響，用復合酶液酶解破壁后，低速1500 r/min離心10 min，再用高滲溶液洗滌，G2漏斗過濾未酶解的菌絲，即可得到原生質體懸液。原生質體隨著酶解時間的增加而增多，見圖1～3，選擇酶解時間3 h左右。

2.2 誘變劑劑量的選擇

2.2.1 紫外照射時間的選擇

隨著照射時間增加，菌絲和原生質體的致死率增加，選擇20 W距離20 cm照射時間選擇40 s為菌絲紫外誘變的最佳條件，30 s為原生質體紫外誘變的最佳條件。

2.2.2 氯化鋰濃度的選擇

氯化鋰處理時間均為3 h，隨著氯化鋰濃度增加，菌絲和原生質體的致死率增加，選擇9%～10%濃度的氯化鋰處理3 h為氯化鋰誘變的最佳條件。

2.2.3 復合誘變條件的選擇

參考單因素實驗結果，將紫外照射時間、氯化鋰濃度適當降低進行復合誘變（表1～2）。

選擇復合誘變的劑量為紫外照射30 s+10%氯化鋰處理菌絲3 h，重復兩次復合誘變，致死率73.2%和84.5%（表3）。

選擇復合誘變的劑量為紫外照射20s+8%氯化鋰處理原生質體3 h，重復兩次復合誘變，致死率75.5%和70.4%（表4）。

最后確定復合誘變條件為：紫外照射30 s+10%氯化鋰處理GZ19的幼嫩菌絲懸液3 h，紫外照射

20 s+8%氯化鋰處理GX34原生質體3 h。

2.3 搖瓶初篩和復篩結果

2.3.1 第一輪復合誘變

以GZ19作為出發菌，經第一輪復合誘變，篩選到一株菌GX34，初篩和復篩數據見表5。

GX34初篩和復篩效價比出發菌株GZ19最高效價增加10%左右，其中GA7含量占比4%～5%，GA4含量占比95%～96%。

2.3.2 第二輪復合誘變

以GX34作為出發菌，經第二輪復合誘變，篩選到一株菌GX34-4，初篩和復篩數據見表6。

GX34-4初篩和復篩效價比出發菌株GZ19最高效價增加25%左右，其中GA7含量占比3%～5%，GA4含量占比95%～97%。

2.4 遺傳穩定性驗證

將菌株GX34-4在PDA平板上連續傳代5代，GA4+7效價結果見圖5。

GX34-4連續傳代5代，效價和F1代相比沒有發生明顯下降，GA4和GA7的占比也沒有明顯變化，遺傳性狀穩定。

2.5 高產突變株GX34-4在50 L發酵罐中的發酵結果

50 L發酵罐采用兩級發酵，種子罐培養溫度

30 ℃，培養周期40～48 h，尾碳二次降低后轉種，接種量10%（V/V），發酵罐通過流加50%葡萄糖進行補料，溶氧不低于20%，中期用氨水調控pH，培養溫度33 ℃，發酵周期8～9 d[6]。

通過對初始工藝進行優化，將淀粉用α-耐高溫淀粉酶解替代50%葡萄糖進行補料，可降低成本，效價與用葡萄糖補料相當，工藝穩定后再重復兩次上罐，產量穩定（表7）。

2.6 高產突變株GX34-4發酵液的提取結果

采用板框固液分離-三級膜純化-溶劑萃取-減壓濃縮的方法提取GA4+7成品。將50 L發酵罐的發酵液用板框分離后，清液經0.2 μm微濾膜純化，微濾清液由2000 Da超濾膜除雜，納濾濃縮10～15倍，然后將納濾濃縮液分段酸化，并使用有機溶劑進行萃取，萃取液減壓濃縮后，獲得了GA4+7成品。提取收率90%左右，其中GA4含量89%，GA7含量1%。

3 結論

以外觀和產量不穩定的GZ19為出發菌，采用紫外加氯化鋰復合誘變和迭代誘變處理，篩選到了一株突變型菌株GA4+7，其搖瓶效價與出發菌株相比提高約25%，50 L發酵罐效價提高約40%，且遺傳性狀穩定，傳代5代效價沒有發生明顯降低。并通過初步工藝探索，用淀粉酶解液替代葡萄糖進行補料，降低了生產成本，最終獲得成品GA4+7，提取收率為90%，GA4含量89%，GA7含量1%。

參 考 文 獻

Macmillan J. Occurrence of gibberellins in vascular plants， fungi， and bacteria[J]. J Plant Growth Regul， 2002， 20： 387-442.

顏方貴， 秦杰， 何增國， 等. 赤霉素A4、A7的研究進展[J].微生物學通報， 1994， 21（3）： 163-167.

李佼佼， 楊文革， 胡永紅. 赤霉素A4+7的分子生物學研究進展[J]. 河南農業科學， 2013， 42（5）： 1-4.

譚紅， 龔革， 李志東， 等. 利用原生質體誘變技術篩選脫落酸高產菌株[J]. 應用與環境生物學報， 1998， 4（3）： 281-285.

張文宣， 趙南， 張金兒， 等. 赤霉素產生菌原生質體理化誘變－定向篩選模型的建立與應用[J]. 化學與生物工程， "2012， 29（1）： 66-69.

張文宣， 劉義雄， 周金龍， 等. 赤霉素GA4+7在5000L發酵罐中的中試發酵工藝[J]. 農藥， 2011， 50（11）： 805-807.