Aspergillus cristatus LJSC.2006的分離鑒定及對茯茶發花品質的影響

摘要：為探究自行分離純化菌株LJSC.2006對湖南茯茶主要黑毛茶發花品質的影響，綜合菌落平皿形態、孢子電鏡掃描特征、菌絲體分子標記鑒定結果，確定菌株LJSC.2006為冠突曲霉菌（Aspergillus cristatus LJSC.2006，GenBank登錄號：MZ147025）。運用感官審評、生化成分分析、HS-SPME/GC-MS揮發性組分分析等方法比較黑毛茶及其發花茶樣的滋味、香氣品質，發現黑毛茶發花后干茶色澤加深，金花滿披，菌香顯露，滋味醇和；滋味成分黃酮、茶多酚、可溶性糖、游離氨基酸、酯型兒茶素、楊梅素、槲皮素含量總體呈下降趨勢；香氣成分增加，醛類、酯類相對含量增多，苯乙烯和雪松醇為黑毛茶共有香氣成分，（E）-芳樟醇-3，7-氧化物和苯乙酮為發花茶樣共有香氣成分；黑毛茶發花后，水楊酸甲酯、（E，E）-2，4-庚二烯醛、（E）-芳樟醇-3，7-氧化物、（E）-呋喃氧化芳樟醇、（E）-2-壬醛、（E）-2-已烯醛、（E）-2-（Z）-6-壬二烯醛、苯乙酮、（E）-2-壬烯醛及香葉酸甲酯等10種特征性揮發成分相對含量明顯上升，綜合形成了金花散茶的菌花香。

關鍵詞：冠突曲霉菌；菌種鑒定；黑毛茶；金花散茶；發花品質

中圖分類號：S571.1；TS272.5⁺4 """"""""""文獻標識碼：A""""""""""""文章編號：1000-369X（2024）04-639-16

Isolation and Identification of Aspergillus cristatus"LJSC.2006 and Its Effect on Fu Tea’s Quality

XIAO Juanjuan¹， CHENG"Ying²， LIU Yan³， LIU Qiaofang¹， JIANG Ating¹， HUANG Jian'an^{1，4，5，6}，WANG Kunbo^{1，4，5，6}， LIU Zhonghua^{1，4，5，6}， WANG Zhenhong^2*， YU Lijun^{1，4，5，6*}

1. Key Lab of Ministry Education of Hunan Agricultural University for Tea Science， Changsha 410128， China; 2. College of Resources and Environment， Xizang Agricultural and Animal Husbandry University， Linzhi 860000， China; 3. Yiyang Testing Institute of Product"and Commodity Quality Supervision， Yiyang 413099， China; 4. National Research Center of Engineering and Technology for Utilization of Botanical Functional Ingredients， Changsha 410128， China; 5. Co-Innovation Center of Education Ministry for Utilization of Botanical Functional Ingredients， Changsha 410128， China; 6. Key Laboratory for Evaluation and Utilization of Gene Resources of Horticultural Crops， Ministry of Agriculture and Rural Affairs of China， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， China

Abstract："This study investigated"the effect of self-isolated and purified strain LJSC.2006 on the quality of Hunan Fu tea， a primary dark tea. Strain LJSC.2006 was identified as Aspergillus"cristatus"（Aspergillus"cristatus"LJSC.2006， GenBank accession number： MZ147025） through colony plate morphology， spore electron microscopy， and mycelial molecular marker identification."Sensory evaluation， biochemical composition analysis and head space solid phase microextraction/gas chromatography-mass spectrometry methods were applied to assess the flavor and aroma qualities of dark tea raw materials and fermented Jinhua loose tea. The results indicate that compared with the primary dark tea， the"fermented"loose tea sample exhibited a"deeper color， the golden flowers，"a"richer fungus aroma， and a mellower taste. After fermentation by Aspergillus cristatus"LJSC.2006， there was a decrease in the levels of flavor quality components such as tea polyphenols， soluble carbohydrates， free amino acids， flavonoids， ester-catechins， myricetin， quercetin and kaempferol. The aroma components， esters and aldehydes of the loose tea samples"increased after fermentation. Styrene and cedrol were the common aroma components in the primary dark tea. （E）-linalool 3，7-oxide and acetophenone were the common aroma components in the fermented loose tea. Additionally， ten characteristic volatile components relative content were significantly increased， including methyl salicylate， （E，E）-2，4-heptadienal， （E）-linalool-3，7-oxide， （E）-furan oxidized linalool， （E）-2-nonanal， （E）-2-hexenal， （E，Z）-6-nonanal， acetophenone， （E）-2-nonanal， and methyl vanillate， which together contributed to the distinctive fungal fragrance of Jinhua loose tea.

Keywords： Aspergillus cristatus， fungi strain identification， primary dark tea， Jinhua loose tea， fermented quality

“金花”菌是茯茶“發花”品質特征形成的優勢益生菌，其數量與質量是衡量茯茶品質優劣的重要指標^[1]。“金花”菌利用茶葉中的內含物質進行生命活動，并使發花茯茶菌香凸顯、澀感降低、醇和回甘^[2]。藥理學研究表明，茯茶富集了茶多糖、茶褐素等生物活性物質，具有降血糖^[3]、降血脂^[4]、改善糖脂代謝^[5]、調節腸道菌群^[6]、調節免疫^[7]等功效。湖南茯茶加工主要是以櫧葉齊、云臺大葉、桃源大葉3個茶樹品種制得的黑毛茶為原料，毛茶鮮葉采摘成熟度較高，內含成分豐富，制茶品質優良，黑毛茶加工后一些廠家還會進行七星灶熏煙、剔梗等工序處理，形成了安化黑茶的特征風味^[8]。

研究顯示，“金花”菌存在變種或亞種^[9]，安化茯茶品質的差異可能與金花菌種的發酵密切相關。當前“金花”菌的鑒定主要依靠形態學觀察或對其內源轉錄間隔區（Internal transcribed spacer，ITS）序列比對分析，導致鑒定結果存在爭議，出現“一菌多名”的現象^[1]。齊祖同等^[10]早期從茯磚茶中將“金花”菌分離鑒定為冠突散囊菌（Eurotium cristatum），目前多采用該命名法，但根據最新國際植物命名法規，已將散囊菌屬（Eurotium）內菌種移入曲霉屬（Aspergius）^[11]。呂嘉櫪等^[12]通過形態觀察結合ITS區序列比對分析，將從陜西茯茶中分離得到的“金花”菌鑒定為針刺曲霉（Aspergillus spiculosus）、阿姆斯特丹曲霉（Aspergillus amstelodami）、謝瓦曲霉（Aspergillus chevalieri）。已有研究表明，β-微管蛋白（β-tubulin，BenA）基因、鈣調蛋白（Calmodulin，CaM）基因及RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ，RPB2）基因可用于曲霉屬真菌的區分和鑒定^[11]。譚玉梅等^[13]利用形態學特征結合多基因系統發育分析，將貴州地區茯磚茶中的8株金花菌鑒定為冠突曲霉。本研究基于湖南茯茶的差異特征，收集湖南多個茯茶加工廠、歷史年份跨度大的茯茶產品，從中分離純化出表觀形態特征差異顯著的金花菌株LJSC.2006，綜合形態結構特征和多基因系統發育分析對金花菌株LJSC.2006進行準確分類鑒定，進而以其作為唯一菌種對湖南茯茶加工的3種主要黑毛茶原料進行發花，分析發花前后茶葉滋味品質、香氣組分的差異，以期為今后茯茶新菌種資源LJSC.2006的工廠化生產與綜合應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

優質茯磚茶原料來自湖南省益陽茶廠有限公司、湖南省白沙溪茶廠股份有限公司、湖南華萊生物科技有限公司、中茶湖南安化第一茶廠有限公司，從中分離純化金花菌株LJSC.2006，使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（Potato dextrose agar，PDA）試管斜面保存，儲存于湖南農業大學茶學教育部重點實驗室。黑毛茶樣品由湖南安化代表性茶廠提供（編號1、3、5、7、9、11），金花散茶參照Xu等^[14]方法發花得到（編號2、4、6、8、10、12），具體信息如表1所示。菌種分離純化、鑒定培養、散茶發花等均在湖南農業大學茶學教育部重點實驗室進行。

1.2 主要試劑

RNase A、Taq"Buffer（含Mg²⁺）、dNTP Mixture、λ"DNA/Hind Ⅲ、Taq"DNA Polymerase、GelStain核酸染料、DNA Marker購自天根生化科技（北京）有限公司；N，N-二甲基甲酰胺、甲醇、乙腈（色譜純）購自美國天地有限公司；沒食子酸、可可堿和兒茶素標準品購自美國Sigma公司；槲皮素、楊梅素和山柰酚標準品購自成都曼斯特生物科技公司；異丙醇、氯仿、異戊醇、氯化芐、福林酚、甲醇、碳酸鈉、茚三酮、磷酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、三氯化鋁、蒽酮、硫酸（分析純）等購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.3 主要儀器設備

SEM-6380LV型掃描電子顯微鏡，日本電子株式會社；IX71倒置式顯微鏡，日本OLYMPUS公司；Gene Genius型號凝膠成像系統，英國Syngene公司；Veriti PCR儀，新加坡Applied Biosystems公司；LC1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司；UV-1750型紫外可見分光光度計、LC-M20A型分析型高效液相色譜、GC/MS-QP2010型氣相色譜-質譜聯用儀，日本島津公司；手動SPME進樣器、PDMS/DVB固相微萃取頭，美國Supelco公司。

1.4 冠突曲霉菌分離鑒定

1.4.1 分離純化

采用真菌分離純化培養技術，根據菌落質地、顏色等形態特征從優質茯磚茶中進行初步分離，再經3～5次劃線、分離、純化，得到菌落形態純凈的菌株接種于PDA平皿固體培養基，于28 ℃、相對濕度80%的生化培養箱中培養6～7 d，再轉接于試管斜面培養3～4 d，4 ℃冰箱保存備用。

1.4.2 平板菌落形態及光學顯微鏡觀察

菌落形態觀察：分離純化的冠突曲霉菌采用三點法接種于PDA固體培養基中，于28 ℃、相對濕度80%的生化培養箱中培養4～10 d，定期觀察其菌落發展、發育形態。

光學顯微鏡觀察：將無菌蓋玻片以約45°角度插入PDA固體培養基中培養，待菌絲擴展至蓋玻片處，從4 d開始，每隔2～3 d取下代表性蓋玻片，在載玻片上點1～2滴棉藍染色液，沿蓋玻片一側小心放上，趕出氣泡、于光學顯微鏡下觀察孢子及菌絲體形態。

1.4.3 電鏡觀察

將目標菌種接種至PDA固體培養基，于28 ℃、相對濕度80%的生化培養箱中培養14～21 d，從成熟的菌落表面刮下孢子、涂布、干燥制片，用掃描電鏡觀察其分生孢子、子囊孢子及其他結構。

1.4.4 PCR擴增

將分離純化得到的LJSC.2006進行平板涂布，28 ℃培養3～4 d，用無菌不銹鋼小鏟收集菌絲體，超聲波振蕩、氯化芐法提取并純化基因組DNA；引物設計參考文獻[15-18]（表2），基因序列擴增反應體系為2×San Taq"PCR Mix"2.5 μL，模板DNA 5 μL（50 ng），上下游引物（10 pmol·μL^-1）各1 μL，無菌雙蒸水補足至25 μL，擴增程序參考史云峰等^[19]方法。PCR產物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

1.4.5 序列比對和系統發育樹構建

下載Hubka等^[11]關于曲霉屬曲霉組分類系統的各種衍生模式（Ex-type）菌株及外類群榛色鉤囊菌Hamigera avellanea（Thom amp; Turesson）Stolk amp; Samson的上述基因序列，在MEGA"7中分別與菌株LJSC.2006對應基因的測序結果進行比對。將基因比對結果合并后在MEGA"7中構建系統發育樹。最大似然法（Maximum likelihood）采用Kimura 2-parameter+G模型，自展（Bootstrap）1 000次檢驗。

1.5"發花茶樣制備

金花散茶制備參考Xu等^[14]的方法進行，基本工藝流程：黑毛茶→稱樣→復水→滅菌→接種→發花→干燥→金花散茶成品。

工藝參數：（1）稱取黑毛茶100.00 g置于三角瓶中；（2）黑毛茶均勻噴水至終含水量約為30%，靜置2～4 h待水分分布均勻；（3）將三角瓶封口后于121 ℃滅菌20 min，取出置于超凈工作臺中冷卻至室溫；（4）接入7.5 mL活化的LJSC.2006菌液（菌液的孢子懸液密度為每毫升1×10⁶～1×10⁷個）；（5）于28 ℃、相對濕度80%的恒溫恒濕培養箱中發花10～14 d，觀察到冠突曲霉菌孢子分布整瓶茶樣后終止發酵；（6）70～80 ℃烘90～120 min至含水量小于10%，4 ℃保存備用。

1.6"感官審評方法

感官審評參考GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》進行，審評小組由3名具有長期審評經驗的專業技術人員和2名茶學專業研究生組成。將12個茶樣分為黑毛茶和發花散茶組，分組評定其外形、湯色、香氣、滋味、葉底，發花組加評金花菌的附著程度和顆粒顏色，對茶樣每項審評因子進行打分，最終結果進行加權計算獲得總分。

1.7"化學品質成分分析

水浸出物含量、茶多酚含量、游離氨基酸含量的測定分別參照GB/T 8305—2013、GB/T 8313—2018、GB/T 8314—2013進行；可溶性糖含量測定采用硫酸-蒽酮比色法，黃酮含量測定采用三氯化鋁比色法^[20]。

沒食子酸、咖啡堿、可可堿、兒茶素含量檢測參照Samanidou等^[21]方法，試液制備采用常規浸提（GB/T"8313—2018），浸提液過0.45 μm纖維膜備測。A相為0.2%磷酸，B相為乙腈甲醇溶液（V_甲醇∶V_乙腈=95∶5），色譜柱為Welchrom C₁₈柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），柱溫30 ℃，流速0.8 mL·min^-1，檢測波長278 nm，進樣量10 μL。

楊梅素、槲皮素、山柰酚含量的測定參考李家華等^[22]方法，色譜柱為Welchrom C₁₈柱（4.6 mm×200 mm，5 μm），流動相A為0.2%磷酸，B相為100%甲醇，梯度洗脫，流速為1 mL·min^-1，柱溫30 ℃，進樣量10 μL，檢測波長360 nm。

1.8"香氣成分檢測

GC-MS檢測方法：稱取2.0 g磨碎茶樣于20 mL萃取瓶中，封口，于80 ℃水浴平衡10 min，然后將老化好的萃取頭插入樣品瓶頂空部分，吸附50 min后取出，隨即插入儀器進樣口，于250 ℃解析5 min，進行數據采集分析。

GC條件：HP-88石英毛細管柱（100 m×0.25 mm，0.20 μm），進樣口溫度240 ℃，流速1.37 mL·min^-1。升溫程序為初始溫度60 ℃保持5 min；以3 ℃·min^-1升至140 ℃，保持5 min；以5 ℃·min^-1升至210 ℃，保持10 min；以5 ℃·min^-1升至240 ℃，保持10 min。不分流進樣，載氣為He。

MS條件：離子源（EI），離子源溫度200 ℃，轉接口溫度220 ℃，電子能量70 eV，掃描范圍為荷質比（m/z）45～500。

1.9"數據處理

采用Excel對數據進行初步整理，使用SPSS"19.0進行單因素方差分析（ANOVA），P＜0.05表示有顯著差異；使用GraphPad Prism"7、聯川生物云平臺、SIMCA"14.1對數據進行相關圖形制作；根據總離子流圖、NIST"17譜庫檢索，根據保留時間和質譜確認揮發性成分，結合文獻、篩選相似度大于80%的揮發性成分進行定性分析；采用峰面積歸一化法計算揮發性成分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 金花菌LJSC.2006的形態學及分子鑒定

2.1.1 菌落平皿生長形態

金花菌LJSC.2006菌株4、7、10 d生長形態如圖1A～圖1F所示，隨培養時間的延長，菌落色澤加深、形態增大、色素分泌增多；菌落外圈呈黃色，中央由褐黃色轉變為黑褐色，背面外圈由淺黃色轉為黃色，中央黃色轉為深褐色；同心圓狀菌落直徑明顯增大，中央內陷，逐漸呈現輻射狀褶皺，內圈有黑色小水珠分泌，褐色色素大量擴散于培養基中。黑毛茶接種LJSC.2006菌發花過程中，能明顯觀察到“金花”生長，且散茶“金花”繁密程度（圖1G）優于輕壓茯茶（1H）。

2.1.2"光學顯微鏡下孢子的發育進程

光學顯微鏡視野中（圖1I～圖1L）可觀察到菌絲有隔膜，呈不對稱分枝，子囊果混生于菌絲中，呈近球形或梨形（圖1I）；閉囊殼無子座，無孔口，內有大量球形或近球形子囊呈不規則排列（圖1J）；成熟后，閉囊殼無規則破裂釋放包含子囊孢子的子囊，子囊呈球形或近球形（圖1K、圖1L）。

2.1.3 孢子電鏡形態觀察

在掃描電鏡下對LJSC.2006菌進行觀察（圖1M～圖1P），分生孢子頭呈較疏松的掃帚狀，孢梗莖長100～250 μm，直徑7～12 μm；分生孢子串生在分生孢子頭上，主要呈橢球形，外壁粗糙且生有小刺，長度在4～5 μm，直徑為3～4 μm（圖1M）；子囊果球形或近球形，直徑在100～150 μm（圖1N），易破裂釋放子囊，子囊呈球形或近球形（圖1O）；子囊成熟后釋放子囊孢子，子囊孢子呈雙凸鏡形，表面粗糙，具尖疣，“赤道”部分繞有兩圈縱向的“冠狀”凸起，每個孢子大小約（4～5） μm×（5～6） μm（圖1P）。

2.1.4"系統發育進化樹構建及分析

僅使用ITS區不能對曲霉屬曲霉組內的物種進行有效區分。本研究經過對ITS、BenA、CaM、RPB2雙向測序、拼接，最終獲得菌株LJSC.2006的ITS、BenA、CaM、RPB2序列。將BenA、CaM及RPB2序列比對結果合并，以榛色鉤囊菌（H. avellanea）為外類群構建系

統發育樹，其他參考菌株的基因序列信息參考文獻[11]。由圖2可知，菌株LJSC.2006和A. cristatus"NRRL4222在99%置信度下屬于同一分支。根據形態特征和分子生物學特征，將LJSC.2006鑒定為冠突曲霉菌（A."cristatus）。

2.2 LJSC.2006對發花茶樣滋味品質的影響

2.2.1 感官品質分析

LJSC.2006為冠突曲霉菌家族中的成員，可能為新變種，用純化的LJSC.2006菌株對湖南主體黑毛茶進行發花。結果發現，湖南主體黑毛茶經LJSC.2006發花后，感官品質均顯著提升，提高了綜合評分（表3）。發花后，干茶色澤加深，油潤度提高，條索勻齊度更佳，表面滿披金花（顆粒金黃飽滿）。發花后茶樣均有濃郁菌花香，不同黑毛茶樣品香氣品質有所差異，經熏煙處理的白沙溪茶廠茶樣ZBP、TBP黑毛茶發花后，還保留了獨特的松煙香。茶湯以橙黃明亮為主，發花茶樣湯色整體趨于一致，云臺山櫧葉齊ZAP發花后湯色由淺變深，白沙溪櫧葉齊ZBP湯色由渾濁轉明亮。此外，發花茶樣滋味更醇和、醇較厚，苦澀味減少；葉底色澤加深、葉質變柔軟。

2.2.2 常規生化成分分析

由常規生化成分含量分析結果可知（表4），黑毛茶經LJSC.2006發花后，水浸出物含量以上升為主，茶多酚和游離氨基酸含量下降，黃酮和可溶性糖含量無明顯的規律性變化。水浸出物含量增幅最大為TBP（12.21%），除YBP外，其余黑毛茶樣品發花后水浸出物含量不同程度上升。除了YAP、TBP發花后黃酮含量略微上升，其他黑毛茶樣品發花后黃酮含量均下降，YBP發花后降幅最大，達17.74%；ZBP發花后可溶性糖含量增幅最大，達29.52%，TAP發花后可溶性糖含量降幅最大，達17.31%；YBP發花后茶多酚含量降幅最大，達34.66%；TAP發花后游離氨基酸含量降幅最大，達35.02%。

2.2.3 HPLC化學組分分析

HPLC分析結果顯示（表5），黑毛茶經LJSC.2006發花后，沒食子酸含量除ZBP外均顯著上升，咖啡堿含量變化以上升為主，可可堿升降皆有，兒茶素、楊梅素、槲皮素、山柰酚含量呈下降趨勢，但變化存在差異。黑毛茶發花后，沒食子酸含量總體上升，TAP增幅最大，達1 006.12%。咖啡堿除YAP、YBP外，其他黑毛茶發花后茶樣含量均上升，ZBP增幅最大，達18.18%。YAP、YBP和ZAP發花后可可堿含量下降，YAP降幅最大，達65.00%；TBP發花后可可堿增幅最大，達18.75%。大多數茶樣中酯型兒茶素（ECG、GCG、EGCG）、非酯型兒茶素（EGC、EC、DL-C）含量顯著下降，酯型兒茶素中ECG、GCG、EGCG均在ZAP發花后降幅最大，分別為95.00%、89.95%、95.88%；非酯型兒茶素中EGC和EC均在ZBP發花后降幅最大，分別為61.94%、54.97%；DL-C在TAP發花后樣品中降幅最大，達41.63%，在YAP和ZAP發花后樣品中增幅較大，分別為204.03%和185.00%。楊梅素、槲皮素、山柰酚含量呈下降趨勢，楊梅素與槲皮素均在YBP發花后樣品中降幅最大，分別達68.10%、60.00%，山柰酚含量在ZAP發花后樣品中降幅最大，達20.95%。

2.3 LJSC.2006對發花茶樣香氣組分的影響

2.3.1 主要香氣組分及相對含量的變化分析

所有茶樣通過HS-SPME/GC-MS共檢測出72種香氣成分（表6），包括碳氫類14種、醇類16種、醛類10種、酮類10種、酯類6種、酚類4種、內酯類1種、含氮化合物6種、雜氧化合

物5種，其中碳氫類、醇類、醛類香氣物質相對含量較高，其次是酮類和酯類。黑毛茶經LJSC.2006發花后，發花茶樣醛類和酯類香氣成分含量增加，除YBH外，其他茶樣均出現雜氧化合物，其他組分香氣成分基本降低（圖3A）。黑毛茶與其發花茶樣共有香氣49種，發花茶樣特有香氣成分16種，黑毛茶特有香氣成分7種（圖3B），所有黑毛茶發花后香氣成分種類增多（圖3C）。12個茶樣共有香氣物質13種，苯乙烯和雪松醇為黑毛茶共有香氣成分，但在發花后消失，（E）-芳樟醇-3，7-氧化物和苯乙酮為發花后新產生的共有香氣成分（圖3D、圖3E）。

2.3.2 黑毛茶及發花茶樣特征性香氣物質分析

對所有揮發性成分進行主成分分析（PCA），該模型R²X=0.430，Q²=0.023，擬合效果良好。PCA結果表明，黑毛茶與發花茶樣香氣成分存在顯著差異（圖4A）。為進一步分析LJSC.2006發花對不同黑毛茶香氣成分的影響，構建OPLS-DA模型，該模型擬合參數為R²X=0.483，Q²=0.899，表明具有較好的分離和預測能力。基于OPLS-DA模型制作Biplot圖（圖4B）和置換檢驗圖（圖4C，n=200），Biplot圖表明黑毛茶與金花散茶的揮發性成分有明顯差異；置換檢驗圖中Q²回歸線與縱軸的相交點小于0（R²=0.933，Q²=﹣0.282），說明OPLS-DA模型不存在過擬合，模型驗證有效，該結果可用于黑毛茶發花前后鑒別分析。

根據OPLS-DA判定模型，以VIP＞1.0為黑毛茶發花前后茶樣特征化合物的篩選標準，共篩選28種差異揮發性成分（圖4D），t檢驗（Students’t）中P＜0.05的香氣成分有25。這25種成分為湖南黑毛茶經LJSC.2006發花前后差異香氣成分，分別為苯乙酮、（E）-2-辛烯醛、（E）-芳樟醇3，7-氧化物、（E）-2-壬醛、（E）-2-（Z）-6-壬二烯醛、苯乙烯、（E）-2-已烯醛、異植物醇、5-甲基十五烷、（E）-橙花叔醇、橙花醇、（E，E）-2，4-庚二烯醛、異丁酸葉醇酯、水楊酸甲酯、2，6-二叔丁基對甲酚、苯乙醇、雪松醇、香葉酸甲酯、（E）-氧化芳樟醇（呋喃類）、2-甲氧基苯甲酸甲酯、苯甲醇、香葉基丙酮、鄰苯二甲醚、2-乙酰基吡咯、對丙基苯甲醚；其中水楊酸甲酯、（E，E）-2，4-庚二烯醛、（E）-芳樟醇-3，7-氧化物、（E）-氧化芳樟醇（呋喃類）、（E）-2-壬醛、（E）-2-已烯醛、（E）-2-（Z）-6-壬二烯醛、苯乙酮、（E）-2-壬烯醛及香葉酸甲酯等10種特征揮發性成分在發花后明顯上升，綜合形成了金花散茶的菌花香。

3 討論

結合真菌菌落形態、顯微觀察、孢子電鏡照片及菌絲體的多種類分子鑒定，從優質茯磚茶中自行分離出的金花菌被鑒定為冠突曲霉菌。與已有冠突曲霉菌的相關保守區域進行比對發現，LJSC.2006與已知的金花菌親緣關系密切，但也存在明顯的分支差異。本研究中分離的菌株LJSC.2006與彭曉赟等^[23]對湖南地區茯磚茶所鑒定的金花菌特征基本一致，子囊果之間無束狀菌絲相連，周圍菌絲分布不規則，子囊孢子表面粗糙、具尖疣，但菌株LJSC.2006生長更快、色素分泌快且多。綜合分析其形態學特征及分子鑒定結果，推測菌株LJSC.2006可能為冠突曲霉菌的變種或亞種。金花菌是茯磚茶品質形成的關鍵優勢菌種，不同產區茯磚茶中的金花菌存在種類多樣性，除冠突曲霉菌外，還有謝瓦氏曲霉（Aspergillus chevalieri），且兩者在形態學上十分相似^[24]。雖然形態學觀察在曲霉屬曲霉組的種類鑒定中具有重要的價值，但在外形相似的情況下，CaM、BenA或RPB2能夠提供更加準確的鑒定依據^[11]。

以LJSC.2006對湖南安化主體黑毛茶進行

散茶發花，發花后的產品外形與風味品質均有提升。干茶發花后表面均金花密布，菌香濃郁。經熏煙處理的ZBP、TBP發花后在松煙香基礎上還有濃郁菌花香。ZAP和TAP發花后，水浸出物含量上升，黃酮、茶多酚、游離氨基酸、可溶性糖含量下降，苦澀味的酯型兒茶素顯著減少，沒食子酸含量上升，茶湯滋味向醇厚、醇和轉變，與Xiao等^[25]對冠突曲霉降低茶葉中苦澀味的研究結果相一致。發花過程中微生物生長繁殖所消耗的碳源和氮源主要來自茶葉中的糖類和氨基酸，帶嫩梗的ZAP、YAP中兩者含量更高，發花后其滋味更醇和。黃酮醇類物質楊梅素、槲皮素、山柰酚等含量以下降為主，經過剔梗處理的YBP和TAP楊梅素、槲皮素含量較高，且發花后下降幅度最為顯著，可能是楊梅素、槲皮素在葉片中含量較高，冠突曲霉菌分泌的水解酶促進了其轉化降解^[24]。可可堿、咖啡堿等生物堿在茶葉中呈現苦味，結構相對穩定，變化較小^[26]。

黑毛茶發花后花果香減弱，以菌香為主，部分帶有松煙香，與Li等^[27]研究結果基本一致。本研究發現，橙花叔醇、苯乙醇、苯乙醛、香葉基丙酮、異丁酸葉醇酯等具有花香的物質，以及帶果香的苯甲醇、二氫獼猴桃內酯相對含量降低，部分甚至消失，與審評結果相符。揮發性化合物水楊酸甲酯、芳樟醇和苯乙酮被認為是茯磚茶“菌花香”“花香”和“薄荷”屬性的關鍵組分，這些香氣強度的增加與優勢菌種冠突曲霉菌的代謝有關^[28]。黑毛茶發花后，呈冬青油、草藥香的水楊酸甲酯相對含量顯著升高^[29]。芳樟醇帶有柑橘果香、花香及木香，且香氣柔和、持久；芳樟醇氧化產物表現為較強的木香、花香、萜香、青香氣，（E）-氧化芳樟醇（呋喃類）、（E）-芳樟醇3，7-氧化物含量相對較高且發花后含量上升^[30]。（E，E）-2，4-庚二烯醛、（E）-2-壬醛、（E）-2-已烯醛等醛類化合物在金花散茶中含量較高，參與菌花香形成，對總體香氣有重要的潛在作用^[31]。雪松醇是一種倍半萜醇，帶有雪松木香甜而柔和的氣味，是茯磚茶中一種代表性化合物^[30]，但本研究發現其在發花后減少甚至消失，可能與冠突曲霉菌作為真菌將其轉化有關^[32]。

冠突曲霉菌LJSC.2006作為一種新型發花使用的金花菌種資源，對湖南茯茶加工的主體黑毛茶原料進行散茶發花，發花進程快，產品質量可控。黑毛茶發花后感官品質得到明顯提升，兒茶素類物質減少，滋味醇較厚、醇和，剔梗處理使茶湯滋味更偏醇和；花果香轉變為菌花香，熏煙處理茶樣仍保有松煙香，形成以水楊酸甲酯、（E，E）-2，4-庚二烯醛、（E）-芳樟醇3，7-氧化物、（E）-氧化芳樟醇（呋喃類）、（E）-2-壬醛、（E）-2-已烯醛、（E）-2-（Z）-6-壬二烯醛、苯乙酮、（E）-2-壬烯醛、香葉酸甲酯為主體的菌花香。基于課題組前期研究，菌株LJSC.2001^[33]、LJSC.2005^[34]與LJSC.2006同為優質茯磚茶中分離純化的冠突曲霉菌，比較三者對茯茶的影響發現，發花均能減小不同黑毛茶在茶樹品種和工藝上的差異，且黑毛茶品質越優，其發花效果越佳；LJSC.2001、LJSC.2005與LJSC.2006在相同的茶葉基質上發花后分別呈現淡黃偏白、黃亮、黃色偏深的菌花顆粒，除LJSC.2006發花茶樣湯色以橙黃為主，另兩株菌株發花茶樣的湯色均為紅橙色，滋味醇較厚、不易帶酸味，且LJSC.2006發花后茶樣香氣成分更豐富。后期可與當前烘房發花的優勢金花菌進行比較，對其化學物質進行生理生化方面的研究，進一步探究差異性功能成分。

傳統茯茶加工流程復雜、周期長，與外界環境進行空氣置換，梅雨季節易滋生雜菌。散茶發花是以純化的冠突曲霉菌進行調控發花，茶樣進行滅菌處理、發花環境菌種單一，茶樣發花進程快，杜絕了雜菌的生長，產品質量可控。此外，發花散茶在兼顧傳統茯茶功效的同時，還具有沖泡方便、金花茂盛、菌香明顯等特點，有利于后期各類發花散茶用于小罐茶、袋泡茶工廠化生產，將對茯茶產業發展起到推動作用。后期可選擇不同地區、不同品種的黑毛茶進行發花，探究工藝與原料品種等因素對茯茶品質的影響，進一步提高茯茶生產加工技術。

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