耐碳青霉烯鼠傷寒沙門菌的藥敏及分子特征分析

王燕 王云英 蔣敏 張雨虹 任艷麗 孫濱

摘要：目的 分析鼠傷寒沙門菌的耐藥情況及分子特征，為臨床治療和感染防控提供依據(jù)。方法 對我院分離的鼠傷寒沙門菌CYEY-S001，采用VITEK2-Compact全自動微生物分析系統(tǒng)和K-B紙片法對藥敏結(jié)果進(jìn)行檢測。通過全基因組測序分析其基因和分子特征，并進(jìn)行質(zhì)粒接合試驗(yàn)，研究質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性。利用碳青霉烯酶表型試驗(yàn)檢測其實(shí)所含的碳青霉烯酶類型，PCR確認(rèn)其攜帶的耐藥基因，質(zhì)粒復(fù)制子分型確定質(zhì)粒類型。結(jié)果 該鼠傷寒沙門菌CYEY-S001對除氨曲南之外的青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素全部耐藥，全基因組測序分析表明其為ST34型鼠傷寒沙門菌，含有blaNDM-5、aac（6）-Iaa、floR、cmlA1、sul3和tet（A）等多種耐藥基因。攜帶的質(zhì)粒類型為IncHI2，blaNDM-5位于該質(zhì)粒上，可通過水平轉(zhuǎn)移，結(jié)合子獲得了與鼠傷寒沙門菌完全一致的耐藥結(jié)果。3種碳青霉烯酶表型試驗(yàn)均正確識別出了其攜帶碳青霉烯酶的類型為金屬β-內(nèi)酰胺酶。結(jié)論 碳青霉烯耐藥鼠傷寒沙門菌對感染治療和預(yù)防控制帶來了新的挑戰(zhàn)。新發(fā)現(xiàn)的IncHI2-blaNDM-5質(zhì)粒存在向其他細(xì)菌物種橫向傳播的風(fēng)險(xiǎn)。

關(guān)鍵詞：鼠傷寒沙門菌；碳青霉烯耐藥；表型檢測；質(zhì)粒復(fù)制子分型；IncHI2-blaNDM-5

中圖分類號：R978.1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

The resistance pattern and molecular characteristics

of carbapenem resistant Salmonella typhimurium

Wang Yan， Wang Yunying， Jiang Min， Zhang Yuhong， Ren Yan-li， and Sun Bin

（Department of Laboratory Medicine， the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing 400010）

Abstract ? ?Objective To analyze the resistance pattern and molecular characteristics of carbapenem resistant Salmonella typhimurium， and provide evidence for clinical treatment and infection prevention and control. Methods ? The antibiotic susceptibility testing of carbapenem resistant Salmonella typhimurium CYEY-S001 isolated from our hospital was performed by VITEK2-Compact automatic bacterial analysis system and the K-B disk method. The gene and molecular characteristics were analyzed by whole genome sequencing （WGS）， and the conjugation test was carried out to study the transferability of the plasmid. Carbapenemase phenotypic assays were used to detect the carbapenemase type. PCR was used to confirm the resistance genes， and plasmid replicon typing was used to determine the plasmid type. Results The Salmonella typhimurium CYEY-S001 was resistant to penicillins， cephalosporins and carbapenems except for aztreonam. The WGS analysis showed that the Salmonella typhimurium CYEY-S001 belonged to the ST34 type， which contained blaNDM-5， aac（6）-Iaa， floR， cmlA1， sul3 and tet（A） resistance genes. The Salmonella typhimurium CYEY-S001 contained IncHI2 plasmid， on which blaNDM-5 was located. The antibiotic susceptibility results of the transconjugant were completely consistent with the Salmonella typhimurium CYEY-S001. The three phenotypic tests correctly identified the type of carbapenemase as metal β-lactamase. Conclusion ?Carbapenem resistant Salmonella typhimurium presents new challenges for infection treatment， prevention and control. The newly IncHI2-blaNDM-5 plasmid has the risk of horizontal transmission to other bacterial species.

Key words Salmonella typhimurium; Carbapenem-resistant; Phenotypic assay; Plasmid replicon typing; IncHI2-blaNDM-5

沙門菌是全球食源性疾病的主要原因之一，沙門菌感染已成為一個(gè)重大的公共衛(wèi)生問題，對衛(wèi)生系統(tǒng)造成了越來越大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[1]。據(jù)估計(jì)，全球每年約有9380萬胃腸炎病例和15.5萬例死亡歸因于非傷寒沙門菌，它是引起人類細(xì)菌性腸炎的常見原因。在眾多非傷寒沙門菌血清型中，鼠傷寒沙門菌和腸炎沙門菌是引起人類沙門菌病的兩種最常見的血清型[2]。近年來，鼠傷寒沙門菌的耐藥率一直在增加，多重耐藥的鼠傷寒沙門菌給臨床治療帶來了困難，導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率增長[3]。碳青霉烯類抗生素通常被認(rèn)為是治療多重耐藥細(xì)菌感染的最有效抗菌藥物，隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用和碳青霉烯酶的水平傳播，耐碳青霉烯鼠傷寒沙門菌也偶有檢出[4-5]，對有效治療和感染控制帶來了新的挑戰(zhàn)。本研究結(jié)合表型和基因組數(shù)據(jù)，對分離到的耐碳青霉烯鼠傷寒沙門菌的藥敏譜和分子特征進(jìn)行了分析，并驗(yàn)證了攜帶碳青霉烯耐藥基因的質(zhì)?？赏ㄟ^水平轉(zhuǎn)移，為評估其傳播風(fēng)險(xiǎn)和開展疾病監(jiān)測防控提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

在一個(gè)白血病患者的腹瀉大便樣本中，分離出一株碳青霉烯耐藥的鼠傷寒沙門菌CYEY-S001。該菌通過毅新博創(chuàng)飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步的沙門菌血清型測定按照Kauffmann-White方案進(jìn)行[6]。利福平耐藥的大腸埃希菌EC600作為接合試驗(yàn)的受體菌。利用VITEK2-Compact全自動微生物分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌藥敏試驗(yàn)，并通過K-B紙片法對藥敏結(jié)果進(jìn)行復(fù)核，結(jié)果按照2020版美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（CLSI）規(guī)則和標(biāo)準(zhǔn)判定[7]。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922。

1.2 主要儀器和試劑

哥倫比亞血平板和MH平板（美國賽默飛公司）；沙門菌屬診斷血清（寧波天潤生物藥業(yè)有限公司）、抗菌藥物紙片、MH瓊脂和TSB肉湯（英國Oxoid公司）；Ezup柱式細(xì)菌DNA提取試劑（生工生物工程（上海）股份有限公司）；碳青霉烯酶表型檢測試劑盒（上海原科公司）；碳青霉烯酶檢測卡（北京金山川公司）；Clin-TOF II飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)（北京毅新博創(chuàng)生物科技有限公司）；VITEK2-Compact自動化鑒定和藥敏系統(tǒng)（法國生物梅里埃公司）；PCR相關(guān)試劑（大連TAKARA公司）；PCR儀和凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 細(xì)菌的全基因組測序與生信分析

全基因組測序在生工生物工程（上海）股份有限公司完成。在Illumina Hiseq?平臺上進(jìn)行二代測序，使用SPAdes對二代測序數(shù)據(jù)進(jìn)行拼裝，然后采用GapFiller對拼接得到的contig補(bǔ)GAP，最后采用PrInSeS-G進(jìn)行序列矯正。采用NCBI Blast+將基因蛋白序列與CDD、KOG、COG、NR、NT、PFAM、Swissprot、TrEMBL等多個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，得到其功能注釋信息。根據(jù)基因與Swissprot、TrEMBL的注釋結(jié)果得到GO功能注釋信息。利用KAAS得到基因KEGG注釋信息。通過ResFinder 4.1分析菌株攜帶的所有耐藥基因。通過MLST 2.0檢測菌株所屬的多位點(diǎn)序列分型。

1.4 質(zhì)粒接合試驗(yàn)

挑取供體菌（鼠傷寒沙門菌CYEY-S001）和受體菌（EC600）單個(gè)菌落接種至5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)14 h。而后分別吸取500 ?L受體菌和供體菌，加入到4 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)4 h后，靜置4 h。吸取混合培養(yǎng)菌液100 ?L，均勻涂布在含利福平（200 ?g/mL）-美羅培南（1 ?g/mL）混合抗生素的篩選MH平板上，培養(yǎng)18 h。挑取在篩選平板上生長疑似接合子菌落進(jìn)行質(zhì)譜鑒定及藥敏試驗(yàn)，并進(jìn)行后續(xù)基因測定。

1.5 碳青霉烯酶表型檢測試驗(yàn)

采用改良碳青霉烯滅活試驗(yàn)（mCIM）聯(lián)合EDTA-改良碳青霉烯酶滅活試驗(yàn)（eCIM）檢測碳青霉烯酶表型，具體操作參照CLSI M100[8]。并根據(jù)“CHINET中國細(xì)菌耐藥監(jiān)測網(wǎng)技術(shù)方案（2020年更新版）”，采用3-氨基苯硼酸（APB）和EDTA聯(lián)合酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)法再次確認(rèn)碳青霉烯酶類型（http：//www.chinets.com/Document）。并使用碳青霉烯酶檢測卡初步確認(rèn)菌株攜帶的碳青霉烯酶。

1.6 耐藥基因檢測

在Center for Genomin Epidemioligy（http：//www.genomicepidemiology.org/）利用ResFinder 4.1對獲得的鼠傷寒沙門菌CYEY-S001全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行耐藥基因分析。并提取CYEY-S001、EC600和接合子的DNA，采用PCR方法檢測各種類型的耐藥基因，包括超廣譜β-內(nèi)酰胺酶類（blaCTX-M、blaSHV、blaTEM）、頭孢菌素酶類（blaACC、blaACT、blaMOX、blaEBC、blaDHA）、碳青霉烯酶類（blaNDM、blaKPC、blaIMP、blaVIM、blaOXA-48）、氨基糖苷類（armA、rmtB、aac（6）-Iaa）和喹諾酮類（qnrA、qnrB、qnrC、qnrD、qnrS、aac（6）-Ib-cr）。blaNDM引物序列為：F-5'- ATGGAATTGCCCAATATTATGCACCC-3'，R-5'-TCAGCGCAGCTTGTCGGC-3'，PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，然后95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。其余耐藥基因引物及擴(kuò)增條件見文獻(xiàn)[9]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。陽性擴(kuò)增產(chǎn)物測序后經(jīng)BLAST比對確認(rèn)（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

1.7 質(zhì)粒復(fù)制子分型

在Center for Genomin Epidemioligy利用PlasmidFinder 2.1對獲得的鼠傷寒沙門菌CYEY-S001全基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)粒分析。并采用基于主要質(zhì)粒不相容群復(fù)制子的PCR分型（PBRT）方法，檢測FIA、FIB、FIC、HI1、HI2、I1-Iγ、L/M、N、P、W、T、A/C、K、B/O、X、Y、F和FIIA共18種Inc質(zhì)粒，來確認(rèn)鼠傷寒沙門菌CYEY-S001和結(jié)合子攜帶的質(zhì)粒類型。使用引物及PCR擴(kuò)增條件參照文獻(xiàn)[10]。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。陽性擴(kuò)增產(chǎn)物測序后經(jīng)BLAST比對確認(rèn)。

2 結(jié)果

2.1 菌株鑒定結(jié)果及MLST分型

毅新博創(chuàng)飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)鑒定該菌株結(jié)果為沙門菌屬，沙門血清凝集試驗(yàn)結(jié)果顯示，該菌株血清型為4， [5]， 12：i：-，最終鑒定為鼠傷寒沙門菌。MLST分型比對結(jié)果顯示，該鼠傷寒沙門菌CYEY-S001等位基因類型為aroC-10、dnaN-19、hemD-12、hisD-9、purE-5、sucA-9和thrA-2，屬于ST34型。

2.2 鼠傷寒沙門菌基因組信息

全基因組數(shù)據(jù)顯示，該鼠傷寒沙門菌CYEY-S001的總堿基數(shù)目為5096737 bp，G+C的含量為51.9%，蛋白編碼基因數(shù)目為5088個(gè)，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA數(shù)目為75，核糖體RNA數(shù)目為7，重復(fù)區(qū)域數(shù)目為198，各數(shù)據(jù)庫對基因功能注釋結(jié)果見圖1。

2.3 接合試驗(yàn)結(jié)果

在篩選平板上生長的接合子菌落經(jīng)質(zhì)譜鑒定為大腸埃希氏菌，該接合子對碳青霉烯類和頭孢菌素類抗菌藥物耐藥，對氨基糖苷類藥物的敏感性降低，而對氟喹諾酮類藥物保持敏感。能夠擴(kuò)增出和供體菌相同的碳青霉烯酶耐藥基因，質(zhì)粒分型結(jié)果與供體菌一致，提示接合試驗(yàn)成功，該鼠傷寒沙門菌CYEY-S001攜帶的含blaNDM質(zhì)粒能夠進(jìn)行水平傳播。

2.4 抗生素藥敏試驗(yàn)結(jié)果

鼠傷寒沙門菌CYEY-S001對氨芐西林、氨芐西林舒巴坦、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢吡肟、頭孢替坦、厄他培南、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、妥布霉素、四環(huán)素等16種抗生素耐藥，對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星中介，對氨曲南和阿米卡星及復(fù)方磺胺敏感。所獲得的接合子青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素藥敏結(jié)果與鼠傷寒沙門菌CYEY-S001完全一致，EC600對各種抗生素均敏感。具體藥敏結(jié)果見表1。

2.5 碳青霉烯酶表型試驗(yàn)檢測結(jié)果

mCIM聯(lián)合eCIM結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門菌CYEY-S001的mCIM和eCIM均為陽性，產(chǎn)金屬酶（圖2）；酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)表明，鼠傷寒沙門菌CYEY-S001所產(chǎn)的碳青霉烯酶能夠被EDTA抑制，不能夠被3-氨基苯硼酸抑制，為金屬酶（圖3）。碳青霉烯酶檢測卡檢測結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)，該金屬酶為NDM型碳青霉烯酶（圖4）。接合試驗(yàn)獲得的接合子，酶型檢測結(jié)果與鼠傷寒沙門菌CYEY-S001一致。EC600的表型試驗(yàn)均為陰性。

2.6 耐藥基因檢測結(jié)果

ResFinder 4.1分析結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門菌CYEY-S001攜帶blaNDM-5、aac（6）-Iaa、floR、cmlA1、sul3和tet（A）等多種耐藥基因。PCR檢測結(jié)果顯示，在擴(kuò)增的各類耐藥基因中，鼠傷寒沙門菌CYEY-S001和結(jié)合子的blaNDM和aac（6）-Iaa陽性，blaNDM經(jīng)測序比對分析為NDM-5（圖5）。blaNDM-5和aac（6）-Iaa兩個(gè)耐藥基因位于同一質(zhì)粒上，可以從鼠傷寒沙門菌CYEY-S001轉(zhuǎn)移到受體菌上。

2.7 質(zhì)粒分型結(jié)果

PlasmidFinder 2.1分析結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門菌CYEY-S001攜帶的質(zhì)粒類型為IncHI2。質(zhì)粒復(fù)制子分型結(jié)果表明，鼠傷寒沙門菌CYEY-S001和接合子均能夠擴(kuò)增出IncHI2質(zhì)粒片段（圖6），提示IncHI2為攜帶各種耐藥基因的質(zhì)粒，可通過水平傳播。

3 討論

鼠傷寒沙門菌的宿主眾多，分布廣泛，不僅可以感染動物，也可以通過受污染的食物傳播給人類，且鼠傷寒沙門菌引起的死亡率比沙門菌引起的平均死亡率高3倍[11]。不同ST型的鼠傷寒沙門菌表現(xiàn)出不同的生物學(xué)特性，如毒力和耐藥性。近年來，ST34型鼠傷寒沙門菌的比例逐年增加，已取代ST19成為主要流行的ST型[11]。我們分離到的這株鼠傷寒沙門菌CYEY-S001即為ST34型。藥敏結(jié)果顯示，其對除氨曲南之外的青霉素類、頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素全部耐藥，基因檢測結(jié)果證實(shí)，引起耐藥的主要原因?yàn)閿y帶blaNDM-5碳青霉烯酶耐藥基因。blaNDM基因編碼的NDM碳青霉烯酶屬于B類金屬β-內(nèi)酰胺酶，需依賴金屬離子發(fā)揮其催化活性，能夠水解除氨曲南以外的大多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素。自2009年blaNDM-1在印度發(fā)現(xiàn)以來，目前已經(jīng)出現(xiàn)了近40種blaNDM基因亞型。與NDM-1碳青霉烯酶相比，NDM-5的88（纈氨酸Val→亮氨酸Leu）和154（蛋氨酸Met→亮氨酸Leu）氨基酸發(fā)生改變，導(dǎo)致攜帶blaNDM-5基因的菌株對碳青霉烯類抗生素、頭孢菌素的水解活性增強(qiáng)[12]。blaNDM基因大多數(shù)位于耐藥菌的質(zhì)粒上，攜帶blaNDM基因的質(zhì)粒為其進(jìn)入宿主提供了有利條件，也為blaNDM基因在不同菌屬之間的傳播提供了基礎(chǔ)。

質(zhì)粒是細(xì)菌染色體外的閉合環(huán)狀DNA片段，能夠自主復(fù)制，具有不相容性。腸桿菌目細(xì)菌攜帶耐藥基因的質(zhì)粒不相容群主要有FIA、FIB、FIC、HI1、HI2、I1-Iγ、L/M、N、P、W、T、A/C、K、B/O、X、Y、F和FIIA共18種[10]。本研究顯示，該鼠傷寒沙門菌CYEY-S001攜帶的質(zhì)粒類型為IncHI2。IncHI2質(zhì)粒具有很高的柔韌性和遺傳可塑性，在抗性決定因素的獲得和傳播中起著重要作用[13]。Wang等[14]從1名餐飲工作者中分離到了1株多重耐藥的鼠傷寒沙門菌，其IncHI2質(zhì)粒攜帶mcr-1、fosA3、blaCTX-M-14耐藥基因，有可能成為耐多藥食源性病原體的傳播媒介。Chen等[15]報(bào)道了某醫(yī)院呼吸護(hù)理病房一起由攜帶blaOXA-48的泛耐藥沙門菌的引起的醫(yī)院沙門菌病暴發(fā)的事件，該沙門菌同樣含有的IncHI2質(zhì)粒，上面攜帶了高達(dá)15種耐藥基因。攜帶blaNDM-5的沙門菌感染也有報(bào)道，但是其blaNDM-5基因并不是位于IncHI2質(zhì)粒上[8，16-17]。本課題組分離到這株多重耐藥鼠傷寒沙門菌CYEY-S001含有攜帶blaNDM-5的IncHI2質(zhì)粒，為首次報(bào)道。接合試驗(yàn)證實(shí)，該IncHI2-blaNDM-5質(zhì)粒為自主轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，能夠攜帶耐藥基因進(jìn)行水平傳播，IncHI2-blaNDM-5有可能作為耐藥沙門菌傳播的新途徑。因此進(jìn)一步研究其基因環(huán)境，闡明其遺傳特征，深入探討IncHI2-blaNDM-5質(zhì)粒在鼠傷寒沙門菌中傳播機(jī)制極其重要。

雖然沙門菌引起的腸炎具有自限性，但是感染碳青霉烯耐藥沙門菌后不采取有效的治療措施將會引起嚴(yán)重的后果。由于不同的酶抑制劑對不同類型碳青霉烯酶的抑制作用不同，盡早確定細(xì)菌攜帶的碳青霉烯酶種類對選擇有效抗生素進(jìn)行治療具有重要的意義?；驒z測是檢測碳青霉烯酶的金標(biāo)準(zhǔn)，但是分子方法需要專業(yè)的技術(shù)人員、特殊的檢測設(shè)備、成本昂貴和眾多的潛在靶基因，限制了其在常規(guī)微生物實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。目前，基于碳青霉烯酶特性的各種表型測定方法已被開發(fā)，包括改良Hodge試驗(yàn)、Carba NP試驗(yàn)、mCIM和eCIM、酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)及商品化酶型檢測試劑盒等等，非常適合在在微生物實(shí)驗(yàn)室開展。本研究選擇了mCIM聯(lián)合eCIM、酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)及酶型檢測卡 3種表型檢測方法對鼠傷寒沙門菌CYEY-S001攜帶的碳青霉烯酶進(jìn)行了測定。結(jié)果顯示，3種表型檢測均正確識別出了其攜帶碳青霉烯酶的類型為金屬β-內(nèi)酰胺酶，為后續(xù)臨床治療提供了有價(jià)值的信息。綜合成本、操作繁簡及其優(yōu)缺點(diǎn)，我們推薦酶抑制劑增強(qiáng)試驗(yàn)作為碳青霉烯酶篩查的常規(guī)方法。

由于沙門菌屬的性質(zhì)，在醫(yī)療保健和社區(qū)環(huán)境中都有很大的傳播潛力。碳青霉烯耐藥鼠傷寒沙門菌的出現(xiàn)，對感染治療和預(yù)防控制帶來了新的挑戰(zhàn)。新發(fā)現(xiàn)的IncHI2質(zhì)粒介導(dǎo)的blaNDM-5也存在向其他細(xì)菌物種橫向傳播的風(fēng)險(xiǎn)。深入研究IncHI2-blaNDM-5的傳播機(jī)制，早期監(jiān)測碳青霉烯酶的類型，為臨床醫(yī)生合理選擇抗生素治療，控制其進(jìn)一步傳播具有重要的意義。

參 考 文 獻(xiàn)

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