單分子技術的i 基序DNA動態結構實驗研究

顧江新， 侯錫苗

（西北農林科技大學a.資源環境學院；b.生命科學學院，陜西 楊凌 712100）

0 引言

生物大分子指生物體內的多糖、脂質、蛋白質和核酸等。生物大分子在生命過程中的功能與其結構的動態變化密切相關，“結構決定性質”是現代生命科學得以快速發展的思想基礎［1］。以單個分子作為研究對象，對其行為（包括構象變化、相互作用和相互識別等）進行實時、動態檢測以及在此基礎上的操縱、調控等，有利于揭示生物大分子的作用機制［2-4］。生物大分子的空間尺度在幾十納米量級，無法使用傳統光學顯微鏡檢測其結構變化。單分子熒光顯微鏡利用熒光分子能量共振轉移進行相對位置的測量，具有納米級別的超高分辨率，可用于單分子研究［5-7］。

在人類基因組DNA的高級結構中，通過半質子化的胞嘧啶配對構成非典型四鏈體結構i 基序（intercalated motif，i-motif）受到廣泛關注。i-motif結構多存在于端粒及癌基因的啟動子區，對調節癌基因的表達具有重要作用，已經成為抗癌治療的新靶點［8-9］，i-motif結構的多變性和敏感的pH 依賴性使其在納米機械及藥物遞送系統中獲得應用［10-11］，環境pH 值的變化對i-motif結構產生直接影響，但對于i-motif 的折疊狀態及性質仍缺乏系統的研究。本文實驗通過在含有i-motif結構的DNA 底物上標記熒光對，記錄不同pH值條件下的熒光能量轉移效率，旨在闡明i-motif結構的動態變化過程和作用機制。

1 實驗原理與方法

1.1 實驗原理

圖1 所示為單分子熒光共振能量轉移的基本原理。如圖所示，在某一雙鏈DNA分子的兩端進行熒光標記時，供體（D）熒光分子受激發所發出的熒光通過誘導偶極，會部分被受體（A）熒光分子吸收，然后受體熒光分子被點亮的過程。在該過程中，能量轉移效率與熒光分子間的距離有關，其關系表達式［12］為

圖1 單分子熒光共振能量轉移理論示意圖

式中：FRET為熒光能量轉移效率；R和R0分別為2 個熒光分子的相對位置和特征距離，與光譜重疊面積、溶液離子環境等有關。通過測量反應過程中能量轉移效率即可獲得相對位置變化。

1.2 實驗設備

圖2所示為單分子熒光顯微鏡的光路及實物圖。主要硬件為IX71 倒置顯微鏡（OLYPUS公司），所有器件均固定于其上；LC-605A固態激光器（Cohrent公司）產生特定波長的激光，經過光纖輸入顯微鏡光學系統；通過電動千分尺調節激光的入射角度，使激光經過二色鏡反射在P-545 載物臺（Physik Instrumente公司）上固定的反應槽內部下表面形成全內反射；熒光分子受激發的熒光，經反射系統進入分色箱中，通過DU-897U-CS0-＃BV 電荷耦合器件（Andor Technology 公司）轉換成數字信號輸出。

圖2 單分子熒光顯微鏡

實驗通過MetaMorph圖像工作站對硬件進行管理和控制，可選擇激光波長和強度，利用AutoShutter 功能實現錄像和激光的同步打開、關閉及自動對焦，最終輸出的數字信號也由圖像工作站記錄并進行可視化處理。

1.3 實驗材料

實驗使用PB 緩沖體系。分別將磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀試劑溶解于雙蒸水（1 mol／L），調至不同的pH值（5.8，6.2，6.6，7.0，7.4，8.0），配制出PB 反應溶液（50 mmol／L），加入防止熒光淬滅或發生光漂白的除氧體系，除氧體系由奎諾二甲基丙烯酸酯（4 mmol／L）、D-葡萄糖（0.8%）、葡萄糖氧化酶（1 mg／mL）和過氧化氫酶（0.4 mg／mL）組成。

實驗底物由一條含有i-motif 結構的bcl2 基因序列與一條短雙鏈DNA 退火而成，短DNA 鏈的作用是將底物固定在反應槽表面，如圖3 所示。以單鏈DNA為對照。底物的修飾選用花青素熒光分子Cy3 和Cy5，該熒光對具有熒光效率高、發光穩定和分子量小等優勢。將Cy3 連接至bcl2 序列的3'末端和單鏈DNA的末端，將Cy5 連接至短DNA 鏈的第6 個核苷酸處。此時，bcl2 序列和單鏈DNA分別被夾在2 個熒光之間（見圖3），其結構的輕微變化都將改變2 個熒光之間的距離，進而影響熒光能量轉移效率。

圖3 實驗底物及熒光修飾示意圖

1.4 實驗方法

實驗過程要求室溫恒定為20 ℃，單分子熒光顯微鏡必須提前預熱至穩定狀態，待電荷耦合器件降溫至-80 ℃后才能正常工作。將注射器和移液槍頭連接至反應槽，抽入反應緩沖液對反應槽進行3 次潤洗。將底物稀釋至50 pmol／L，注入反應槽內孵育10 min，底物即被固定于反應槽表面。用反應緩沖液沖走游離的底物，抽入含有除氧體系的成像緩沖液。向物鏡表面滴加香柏油，將反應槽固定于載物臺上。選擇532 nm的激發光，挑選連接均勻且密度適中的視野，每個檢測視野內找到500 ～600 個熒光信號，于1 min 內錄取600 幀數據。對獲取的數據進行篩選、分析和可視化處理。

2 實驗結果與分析

2.1 pH值的影響

圖4 所示為bcl2 基因序列和單鏈DNA在不同pH值條件下的熒光傳遞效率分布（圖中分子數占比表示具有該FRET值的分子數與全部分子數的比例）。由圖可知，當pH ＝6.2 時，bcl2 序列的熒光能量轉移效率分布在0.95 左右顯示1 個單峰，說明i-motif結構處于均勻、完全的折疊狀態；隨著pH值增加至8.0，熒光能量轉移效率分布逐步向左移動，效率峰最終停留在0.40左右，表明i-motif 結構在高pH 值條件下的部分去折疊過程。單鏈DNA 在不同pH 值條件下的熒光能量轉移效率分布均沒有發生移動，效率峰穩定在0.27 左右［見圖4（b）］，說明其結構呈現無規則卷曲狀態。

圖4 在不同pH值下反應底物的熒光傳遞效率分布

2.2 折疊狀態

圖5所示為bcl2 基因序列的動態熒光傳遞效率曲線及形成的C-發夾結構。由圖可知，bcl2 序列的熒光能量轉移效率動態分布曲線擬合出6 個峰，表明imotif結構具有6 個折疊狀態。除了完全折疊的i-motif（最高效率）和無規則卷曲狀態（最低效率）之外，至少還存在4 個中間狀態，分別對應于熒光能量轉移效率峰在0.8、0.7、0.5 和0.4 處。這些是由部分C：C +堿基配對形成C-發夾結構，包括平行發夾、反平行發夾和不完全配對發夾等（見圖5）。由此可見，當pH 值發生改變時，i-motif 可以在多種折疊狀態間進行自發地變構與轉換，推測各折疊狀態可發揮不同的生理功能。

圖5 反應底物熒光傳遞效率動態分布曲線及形成的C-發夾結構示意圖

3 結語

本文實驗利用單分子熒光共振能量轉移技術，對含有i-motif結構的基因序列bcl2 在不同pH值條件下的動態變化進行檢測。結果表明：i-motif 結構具有6個折疊狀態，在低pH值條件下處于均勻、完全的折疊狀態，而在高pH 值條件下部分去折疊；總之，i-motif結構隨pH值的改變可在多種折疊狀態間進行自發地變構與轉換，為進一步探索i-motif 的生理功能提供參考。