基于高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法的植物源性食品中乙基多殺菌素殘留測定

潘劍蕾，王 瑞，曾定玲，林慧純，顧亞萍，王鈺歆，張曉鴻

（深圳市質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測研究院，廣東深圳 518051）

乙基多殺菌素可以有效防治鱗翅目幼蟲、薊馬、潛葉蠅、小菜蛾、甜菜夜蛾、豆莢螟等農(nóng)業(yè)害蟲，并具有廣譜、高效、低毒等特點(diǎn)[1-3]。乙基多殺菌素產(chǎn)品自2009 年4 月首次在我國農(nóng)藥登記以來，廣泛應(yīng)用于植物源性食品中[4-8]，隨之帶來了乙基多殺菌素植物源性食品中殘留的問題[9-11]。因此，關(guān)于乙基多殺菌素在各類植物源性食品中的安全評價(jià)受到越來越多的關(guān)注。《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763）是根據(jù)我國農(nóng)藥殘留試驗(yàn)及監(jiān)測數(shù)據(jù)、居民膳食消費(fèi)數(shù)據(jù)、農(nóng)藥毒理學(xué)數(shù)據(jù)等，經(jīng)過科學(xué)風(fēng)險(xiǎn)評估后制定的，是開展農(nóng)藥安全性評價(jià)和農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管的技術(shù)判定依據(jù)，也是食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的重要組成部分和保障食品安全、保護(hù)公眾身體健康的重要措施。現(xiàn)行有效GB 2763—2021 與首次發(fā)布的GB 2763—2012 相比，對食品中乙基多殺菌素最大殘留限量由1 個(gè)類別3 個(gè)品種增加到8 個(gè)類別48 個(gè)品種，最大殘留限量范圍從（0.1～0.5）mg·kg-1到（0.01～10）mg·kg-1。由此可見，我國對部分品種的乙基多殺菌素最大殘留限量要求越來越嚴(yán)，因而建立測定植物源性食品中乙基多殺菌素殘留量的分析方法具有重要意義。

乙基多殺菌素農(nóng)藥殘留量的檢測分析方法主要有液相色譜法（liquid chromatography，LC）[12-15]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）[16-23]，但目前樣品基質(zhì)主要圍繞土壤、藥材植物（黨參、枸杞）、谷物（水稻）和動(dòng)物源性產(chǎn)品（牛奶、雞肉、豬脂肪）等開展研究，對植物源性產(chǎn)品基質(zhì)中乙基多殺菌素農(nóng)藥殘留量檢測分析的研究目前鮮見報(bào)道。QuEChERS 預(yù)處理方法具有快速、簡單、廉價(jià)、有效、可靠和安全等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用在植物源性產(chǎn)品農(nóng)藥殘留量的檢測分析[24-28]。應(yīng)用QuEChERS方法建立高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS/MS）檢測植物源性食品（蔬菜、水果、食用菌）中乙基多殺菌素殘留的分析方法，可以為植物源性食品中乙基多殺菌素殘留監(jiān)測和風(fēng)險(xiǎn)評估提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 儀器設(shè)備與試劑

XEVOTQ-S高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）、Practum2102電子天平（德國Sartorius公司）、XH-B 型旋渦混合器（江蘇康健醫(yī)療用品有限公司）和3-18K高速離心機(jī)（德國SIGMA公司）。

乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品（純度88.84%，德國Dr.Ehrenstorfer GmbH 生產(chǎn)）、乙腈（色譜純，德國Merck公司生產(chǎn)）、甲醇（色譜純，德國Merck 公司生產(chǎn)）、氯化鈉（分析純，廣東光華科技股份有限公司生產(chǎn)）、乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（primary secondary amine，PSA）（美國Agilent 公司生產(chǎn)）、陶瓷均質(zhì)子（美國Agilent公司生產(chǎn)）和微孔濾膜（美國Agilent公司生產(chǎn)）。

1.1.2 試驗(yàn)材料

依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB 2763-2021）對乙基多殺菌素的食品種類范圍，以及農(nóng)業(yè)部公告2386號(hào)《農(nóng)藥殘留檢測方法國家標(biāo)準(zhǔn)編制指南》[29]對植物源性食品中農(nóng)藥殘留檢測方法制定過程中基質(zhì)材料選擇要求，結(jié)合截至2023 年2 月28 日中國農(nóng)藥信息網(wǎng)農(nóng)藥登記數(shù)據(jù)，目前我國有效期登記共有3 個(gè)乙基多殺菌素產(chǎn)品，其中蔬菜作物有豇豆、黃瓜、玉米、甘藍(lán)、茄子，水果作物有西瓜、葡萄、楊梅樹、芒果。因此，選用蔬菜樣品基質(zhì)為甘藍(lán)、茄子，水果樣品基質(zhì)為葡萄，食用菌樣品基質(zhì)為香菇。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

稱取10.00 g 植物源性食品（蔬菜、水果、食用菌）試樣于50 mL塑料離心管中，加入20.0 mL乙腈及1 顆陶瓷均質(zhì)子，劇烈震蕩1 min，加入5 g 氯化鈉，劇烈震蕩1 min后，4 200 r·min-1離心5 min，移取3 mL提取液于15 mL 離心管中，加入150 mg PSA，渦旋1 min 后，4 200 r·min-1離心5 min，準(zhǔn)確移取2 mL 上清液于玻璃離心管中，在40 ℃水浴下氮?dú)饩徛抵两桑尤?.00 mL 甲醇-水（體積比1∶1）溶液，旋渦混合1 min溶解殘留物，過微孔濾膜，制成上機(jī)待測液。

1.2.2 乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的配制

準(zhǔn)確稱取10.0 mg 乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)品，用乙腈溶劑溶解并定容至10.00 mL，配制成1 000 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，避光-18 ℃以下條件保存。

吸取2.00 mL的1 000 mg·L-1的乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于容量瓶中用乙腈定容至100.00 mL，配制成20.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，避光-18 ℃以下條件保存。

1.2.3 儀器條件

1）色譜條件。流動(dòng)相A 為鹽溶液（5 mmol·L-1乙酸銨+0.05%甲酸溶液），流動(dòng)相B 為甲醇，色譜柱ACQUITY UPLC BEH-C18（1.7 μm 2.1 × 50 mm），柱溫45 ℃，進(jìn)樣量1 μL，流速0.250 mL·min-1，流動(dòng)相梯度0～1 min，B 10%；2～3 min，B 25%；5～6.5 min，B 45%～60%；7.5～8.5 min，B 60%～75%；9～10 min，B 90%～95%；11～12 min，B 95%；12～14 min，B 10%。

2）質(zhì)譜條件。電離模式ESI+，毛細(xì)管電壓3.0 kV，干燥氣溫度450 ℃，干燥氣流速900 L·h-1，錐孔氣流速150 L·h-1，霧化壓力7 Bar，碰撞氣流速0.15 mL·min-1。

2 結(jié)果與分析

2.1 儀器條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

根據(jù)乙基多殺菌素的分子結(jié)構(gòu)特性，采用正離子模式掃描，由于乙基多殺菌素有乙基多殺菌素-J 和乙基多殺菌素-L 兩種本體[30-31]，需分別優(yōu)化其質(zhì)譜參數(shù)。分別手動(dòng)找到目標(biāo)化合物的母離子后，運(yùn)用儀器自帶的Interllistart 功能優(yōu)化其離子對最佳的碰撞能量。乙基多殺菌素2種本體的質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 乙基多殺菌的質(zhì)譜參數(shù)

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

常用的流動(dòng)相溶劑有乙腈和甲醇，由于乙腈和甲醇都是易揮發(fā)的有機(jī)溶劑，且乙腈的毒性較大，基于對檢測人員健康考慮，試驗(yàn)選擇甲醇-水，甲醇-0.05%甲酸水溶液，甲醇-鹽溶液（5 mmol·L-1乙酸銨+0.05%甲酸溶液）3 種溶液作為流動(dòng)相體系進(jìn)行測定。結(jié)果表明甲醇-鹽溶液（5 mmol·L-1乙酸銨+0.05%甲酸溶液）為流動(dòng)相時(shí)，乙基多殺菌素響應(yīng)值較好。經(jīng)優(yōu)化流動(dòng)相梯度得到保留時(shí)間適中、峰型良好的色譜圖。因此，HPLC-MS/MS 法選擇甲醇-鹽溶液（5 mmol·L-1乙酸銨+0.05%甲酸溶液）為流動(dòng)相。

2.2 樣品前處理的優(yōu)化

基于QuEChERS 方法，結(jié)合乙基多殺菌素的特性、植物源性食品基質(zhì)背景特點(diǎn)和對環(huán)境友好等因素，對樣品前處理進(jìn)行優(yōu)化。乙基多殺菌素對酸和堿不敏感，故無需使用緩沖體系。乙腈和甲醇對乙基多殺菌素均有足夠的溶解性，而乙腈的毒性比甲醇的大，基于對環(huán)境友好的考慮，復(fù)溶溶劑選擇甲醇-水（1∶1）。蔬菜、水果和食用菌的主要干擾物質(zhì)是色素、糖類和有機(jī)酸等物質(zhì)，而乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠（PSA）有去除色素、糖類、有機(jī)酸等極性物質(zhì)的作用。試驗(yàn)提取包選擇4 g無水硫酸鎂+1 g氯化鈉、5 g 氯化鈉。凈化包選擇100 mg PSA、150 mg PSA、200 mg PSA。結(jié)果表明2 種提取包都能有效去除樣品中的水分，考慮到加入無水硫酸鎂時(shí)會(huì)迅速結(jié)塊，對后續(xù)的振蕩混勻帶來一定的阻力，因而考慮選擇5 g氯化鈉作為提取包。100 mg PSA 凈化后的試樣顏色較另外兩個(gè)含量稍微深一些，用200 mg PSA 凈化后的試樣乙基多殺菌素-L 回收率在70%～80%，用150 mg PSA 凈化后的試樣乙基多殺菌素-J 和乙基多殺菌素-L回收率均可達(dá)到80%。因此，HPLC-MS/MS 法選擇5 g氯化鈉和150 mg PSA。

2.3 減小基質(zhì)效應(yīng)的影響

通常采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀的ESI源進(jìn)行檢測時(shí)一般會(huì)存在基質(zhì)效應(yīng)。為了結(jié)果的準(zhǔn)確性，減小基質(zhì)效應(yīng)的影響，試驗(yàn)采用基質(zhì)標(biāo)定量，即用不含乙基多殺菌素的空白樣品提取液作為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶劑。

2.4 線性關(guān)系和定量限

取上述配制的20.0 mg·L-1的乙基多殺菌素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，不含乙基多殺菌素的空白樣品提取液為溶劑分別配制成0.005、0.010、0.020、0.050、0.100、0.200 mg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在儀器條件優(yōu)化好的設(shè)備上機(jī)測定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（X，mg·L-1）為橫坐標(biāo)，響應(yīng)值峰面積Y為縱坐標(biāo)作線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)如表2 所示。根據(jù)歐盟殘留監(jiān)控指南的規(guī)定，當(dāng)化合物某一濃度的信噪比＞10時(shí)，即可作為定量限。

表2 不同基質(zhì)中乙基多殺菌素的線性方程

2.5 回收率和精密度

采用在不含乙基多殺菌素的空白樣品中加標(biāo)的方法，測定回收率來驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確率。選擇3 個(gè)水平濃度，每個(gè)水平濃度重復(fù)進(jìn)行6 次平行實(shí)驗(yàn)，得到的添加回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差如表3 所示。數(shù)據(jù)表明，方法的回收率范圍為87.2%～98.8%，方法的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～8.9%，能夠滿足日常檢測需求。

表3 不同基質(zhì)中乙基多殺菌素的平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

3 小結(jié)

建立以高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定植物源性食品（蔬菜、水果、食用菌）中乙基多殺菌素殘留量的分析方法，驗(yàn)證該分析方法的靈敏度、回收率和重復(fù)性等技術(shù)參數(shù)。結(jié)果表明，該方法精密度和準(zhǔn)確性良好，可以達(dá)到乙基多殺菌素定性和定量的分析要求，適用于植物源性食品中乙基多殺菌素殘留的實(shí)際監(jiān)測，具有較好的應(yīng)用價(jià)值。