罌粟生物堿合成關鍵酶STORR的基因克隆及其表達載體構建

摘" 要：為研究罌粟生物堿合成關鍵酶（STORR）在罌粟中的作用，該研究以罌粟葉片cDNA為模板，利用RT-PCR技術，克隆得到STORR基因，并對其序列進行測序分析，利用雙酶切方法構建pCambia2301-KY表達載體。研究結果表明，成功克隆到STORR基因，通過生物信息學分析，該基因包含一個長度為2 703 bp的完整開放閱讀框，編碼900個氨基酸，分子式為C4476H7097N1207O1328S46，理論分子質量為10.05 kD，理論等電點為6.45，不穩定指數為41.70，為不穩定蛋白。用KpnI酶切載體pCambia2301-KY線性化，與回收純化產物進行重組反應，成功構建STORR基因表達載體，將表達載體成功轉化農桿菌GV3101。該研究為后續進行STORR基因功能研究提供理論依據。

關鍵詞：罌粟；STORR基因；基因克隆；過表達載體；生物堿

中圖分類號：S567.21+2" " " 文獻標志碼：A" " " " " 文章編號：2096-9902（2023）15-0073-04

Abstract： In order to study the role of key enzyme of alkaloid biosynthesis （STORR） in opium poppy （also known as Papaver somniferum L.）， STORR gene was cloned from cDNA of opium poppy leaves by RT-PCR technique， and its sequence was sequenced. pCambia2301-KY expression vector was constructed by double enzyme digestion. The results showed that the STORR gene was successfully cloned. Bioinformatics analysis showed that the gene contained a complete open reading frame of 2 703 bp， encoding 900amino acids， the molecular formula was C4476H7097N1207O1328S46， the theoretical molecular weight was 10.05 kD， the theoretical isoelectric point was 6.45and the instability index was 41.70. It was an unstable protein. The expression vector of STORR gene was successfully constructed by linearizing the vector pCambia2301-KY with KpnI enzyme and reacting with the purified product. The expression vector was successfully transformed into Agrobacterium tumefaciens GV3101. This study provides a theoretical basis for the follow-up study of STORR gene function.

Keywords： opium poppy; STORR gene; gene cloning; overexpression vector; alkaloid

嗎啡、可待因、蒂巴因、那可丁和罌粟堿等生物堿是罌粟特有的次生代謝產物，臨床上常用于麻醉、鎮痛、止咳等，極具醫用價值。2018年，葉凱團隊完成了罌粟全基因組測序，利用高質量基因組破譯罌粟中合成次生代謝產物的途徑[1]，對研究罌粟生物堿合成具有重要意義，在對罌粟基因組分析過程中發現STORR基因對罌粟中生物堿合成至關重要。罌粟中生物堿合成分支路徑（圖1）表明[2]，細胞色素P450單加氧酶和醛-酮還原酶的融合蛋白（STORR）是嗎啡、可待因等生物堿合成代謝途徑的關鍵蛋白，調控相應的STORR基因表達，可引起嗎啡、可待因和蒂巴因含量發生變化。目前，對STORR基因的研究基于研究芐基異喹啉類生物堿（BIAs）模型系統[3]，Li等[4]在研究罌粟BIAs代謝途徑過程中發現，STORR蛋白P450與僅相距865 bp的氧化還原酶模塊最為相似，以此假設了STORR基因的融合事件發生時間，進而提出了嗎啡合成途徑的出現時間節點。……