紐約食管鱗狀上皮癌抗原1在原發性肝細胞肝癌組織中的表達及其臨床意義

【摘要】目的 探討紐約食管鱗狀上皮癌抗原1（NY-ESO-1）在原發性肝細胞肝癌（HCC）組織中的表達及其臨床意義，以期為臨床治療該疾病提供參考依據。方法 回顧性分析2013年1月至2019年12月于安徽醫科大學安慶醫學中心接受手術治療的71例HCC患者的臨床資料，并搜集其術后石蠟包埋的肝癌組織與癌旁組織標本，分別作為HCC組、癌旁組；同期回顧性分析30例肝血管瘤或肝內膽管結石患者的臨床資料，并取其術后石蠟包埋的正常肝組織標本，作為正常組。采用免疫組織化學染色法檢測3組患者組織中NY-ESO-1蛋白表達情況；分析NY-ESO-1蛋白表達與HCC患者臨床病理特征的關系；使用Cox比例風險回歸模型分析HCC患者預后的危險因素。結果 HCC組NY-ESO-1蛋白表達陽性率顯著高于癌旁組、正常組；NY-ESO-1蛋白陽性表達患者中腫瘤直徑≥ 5 cm、Ⅱ a ～ Ⅱ b分期、Edmondson分級Ⅲ/Ⅳ級、Ki-67高表達、微血管侵犯（MVI）為M1/2級患者占比均顯著高于NY-ESO-1蛋白陰性表達患者；NY-ESO-1蛋白表達陽性患者的總存活率顯著低于NY-ESO-1蛋白表達陰性患者；Cox比例風險回歸模型單因素和多因素分析結果顯示，腫瘤直徑≥ 5 cm、Ⅱ a ～ Ⅱ b分期、Edmondson分級Ⅲ/Ⅳ級、Ki-67高表達、MVI為M1/2級、NY-ESO-1陽性均是影響HCC患者預后的危險因素（HR=4.106、2.184、5.579、13.967、3.296、2.735）（均Plt;0.05）。結論 NY-ESO-1在HCC組織中呈高表達，且腫瘤直徑≥ 5 cm、Ⅱ a ～ Ⅱ b分期、Edmondson分級Ⅲ/Ⅳ級、Ki-67高表達、MVI M1/2級、NY-ESO-1陽性均是影響HCC患者預后的危險因素，臨床上可針對上述因素采取相應措施，改善患者預后。

【關鍵詞】紐約食管鱗狀上皮癌抗原1 ; 原發性肝細胞肝癌 ; 微血管侵犯 ; 預后

【中圖分類號】R735.7 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-3718.2023.10.0025.05

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2023.10.009

【Abstract】Objective To investigate the expression of New York esophageal squamous cell carcinoma 1 （NY-ESO-1） in hepatocellular carcinoma （HCC） tissues and its clinical significance， in order to provide reference for clinical treatment of this disease. Methods The clinical datas of 71 patients with HCC underwent surgical treatment admitted to Anqing Medical Center of Anhui Medical University from January 2013 to December 2019 were retrospectively analyzed， the paraffin-embedded liver cancer tissue and paracancer tissue samples were collected after surgery， as the HCC group and the paracancer group respectively; the clinical datas of 30 patients with hepatic hemangioma or intrahepatic bile duct calculus were retrospectively analyzed， the paraffin-embedded normal liver tissue samples were collected after surgery， as the normal group. The expression of NY-ESO-1 protein in the three groups were detected by immunohistochemical staining; the relationship between"NY-ESO-1 protein expression and clinicopathologic features of HCC patients were analyzed; the risk factors of the prognosis of HCC patients were analysed by Cox proportional risk regression model. Results The positive expression rate of NY-ESO-1 protein in the HCC group was significantly higher than that in the paracancer group and the normal group; the proportion of patients with tumor diameter ≥ 5 cm， Ⅱ a ～ Ⅱ b stage， Edmondson grade Ⅲ/Ⅳ grade， Ki-67 high expression， microvascular invasion （MVI） grade M1/2 grade in patients with NY-ESO-1 protein positive expression were significantly higher than that in patients with NY-ESO-1 protein negative expression; the overall survival rate of patients with NY-ESO-1 protein positive expression was significantly lower than that of patients with NY-ESO-1 protein negative expression; the results of univariate and multivariate analysis of Cox proportional risk regression model showed that， tumor diameter ≥ 5 cm， Ⅱ a ～ Ⅱ b stage， Edmondson grade Ⅲ/Ⅳgrade， Ki-67 high expression， MVI grade M1/2 grade， and NY-ESO-1 positive expression were all the risk factors for the prognosis of HCC patients （HR=4.106， 2.184， 5.579， 13.967， 3.296， 2.735） （all Plt;0.05 ）. Conclusion NY-ESO-1 is highly expressed in HCC tissues， and the tumor diameter ≥ 5 cm， Ⅱ a ～ Ⅱ b stage， Edmondson grade Ⅲ/Ⅳgrade， Ki-67 high expression， MVI grade M1/2 grade， and NY-ESO-1 positive expression are all the risk factors for the prognosis of HCC patients. In clinic， the corresponding measures can be taken according to the above factors， in order to improve HCC patients’ outcomes.

【Keywords】New York esophageal squamous cell carcinoma 1; Hepatocellular carcinoma; Microvascular invasion; Prognosis

原發性肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma， HCC）是消化系統常見的惡性腫瘤之一，HCC患者早期往往沒有特異性臨床癥狀，僅有右上腹脹悶、納差、乏力等不適，當出現明顯消瘦、腹水、黃疸癥狀時，往往病情已比較嚴重，錯過最佳的治療時機。甲胎蛋白已成為臨床診斷HCC應用最為廣泛的血清指標，但單一應用甲胎蛋白對肝癌的診斷缺乏敏感性[1-2]。因此，尋找到更靈敏可靠的診斷指標是目前臨床肝癌診治中的研究熱點。紐約食管鱗狀上皮癌抗原1（NY-ESO-1）是腫瘤睪丸抗原（CTA）亞家族之一，編碼基因最早發現于食管癌組織cDNA表達文庫中，NY-ESO-1能激發機體產生細胞免疫和體液免疫，在腫瘤的侵襲和進展中起重要作用，被認為是目前免疫原性最強的腫瘤抗原而備受關注[3-4]。目前對于NY-ESO-1在HCC中的表達及其臨床意義尚不明確。鑒于此，本研究旨在探討NY-ESO-1在HCC組織中的表達及其臨床意義，以期為臨床治療該疾病提供參考依據，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 回顧性分析2013年1月至2019年12月于安徽醫科大學安慶醫學中心接受手術治療的71例HCC患者的臨床資料，并搜集其術后石蠟包埋的肝癌組織與癌旁組織標本，分別作為HCC組、癌旁組。71例HCC患者中男性63例，女性8例；年齡37～79歲，平均（58.63±8.15）歲；BMI 18.65～24.54 kg/m2，平均（20.36±0.22） kg/m2；肝功能Child-Pugh分級[5]：A級41例、B級30例。另回顧性分析同期30例肝血管瘤或肝內膽管結石患者的臨床資料，并取其術后石蠟包埋的正常肝組織標本，作為正常組，其中男性25例，女性5例；年齡22～68歲，平均（54.23±7.07）歲；BMI 18.25～24.44 kg/m2，平均（20.31±0.21） kg/m2。兩組患者性別、年齡、BMI比較，差異無統計學意義（Pgt;0.05），可行對比分析。納入標準：HCC患者符合《原發性肝癌規范化診治專家共識》 [6]中的相關診斷標準，且經病理確診為HCC；HCC患者均行肝癌切除術；無自身免疫性疾病或嚴重感染性疾病。排除標準：患有其他惡性腫瘤者；合并內分泌或心血管疾病等基礎疾病患者；臨床資料不完整。研究經院內醫學倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 免疫組織化學染色 采用免疫組化法測定標本組織中NY-ESO-1的表達狀況，標本蠟塊連續切片，厚度4 μm，取完整組織切片放于40 ℃的水中使其展平，切片裱附在防脫片處理的進口載玻片上，陣列切片置于60 ℃恒溫烤箱中烤片16 h，保存于切片盒中，置于冰箱5 ℃保存，切片常規脫蠟、梯度乙醇入水，0.01 mol/L枸櫞酸抗原修復液（pH值6.0）放微波爐中高火加熱5 min至沸騰，自然冷卻15 min以上；3%過氧化氫避光孵育10 min，磷酸鹽緩沖鹽溶液（PBS）沖洗3次，3 min/次；加入一抗NY-ESO-1（1∶500）于4 ℃冰箱過夜。次日取出載玻片后室溫下孵育30 min，PBS沖洗液再沖洗3次，3 min/次；加入檢測試劑盒中的試劑1和試劑2，分別等待25、30 min，使用PBS沖洗液再沖洗3次，3 min/次；DAB顯色，自來水沖洗后組織切片取出，在新鮮的蘇木素染液缸中放置2 min，再采用流動水反復沖洗，脫水透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察。

1.2.2 免疫組織化學染色結果判定 由兩位高年資病理醫師在“雙盲”條件下進行評定，采用半定量積分法對癌細胞染色強度和陽性細胞所占百分比進行評分，計算細胞陽性率：①無陽性細胞為0分，1%～10%陽性細胞為1分，10%lt;陽性細胞≤ 50%為2分，50%lt;陽性細胞≤ 80%為3分，80%lt;陽性細胞≤ 100%為4分。②按照染色強弱：棕褐色表現3分，棕黃色表現2分，黃色表現計1分，不著色記錄0分。將免疫組織化學染色評分=細胞陽性率評分×染色強弱評分，分為3個等級，0～1分為陰性（-），2～4分為弱陽性（+），5～8分為陽性（++），99分及以上為強陽性（+++） [7]。其中陰性為陰性組，弱陽性、陽性、強陽性均為陽性組。

1.3 觀察指標 ①NY-ESO-1在不同肝組織中的表達情況。②NY-ESO-1蛋白表達與HCC患者臨床病理特征的關系，包括腫瘤直徑（lt;5 cm、≥ 5 cm）、腫瘤分期[根據中國肝癌的分期方案（CNLC）分為Ⅰ a、Ⅰ b、Ⅱ a、Ⅱ b期等]、 Edmondson分級（Ⅰ/Ⅱ級、Ⅲ/Ⅳ級）、 Ki-67[低表達（Ki-67指數≤ 10%）、高表達（Ki-67指數gt;10%）]、微血管侵犯（MVI） [MVI定義為病理切片中發現微靜脈內有成團的癌細胞且周圍有明確的內皮細胞環繞，分為M0（未發現MVI）、M1（近癌旁肝組織中出現≤ 5個MVI）、 M2（近癌旁肝組織中出現gt;5個MVI）]。③所有患者均定期隨訪3年或隨訪追蹤至死亡日期，隨訪方式為電話或門診，3個月隨訪1次，記錄患者的生存情況，采用Kaplan-Meier生存曲線分析NY-ESO-1陽性患者與NY-ESO-1陰性患者的總生存率。④使用Cox比例風險回歸模型分析影響行肝癌切除術的HCC患者生存情況的危險因素。

1.4 統計學方法 使用SPSS 26.0統計學軟件進行統計學分析，計數資料以[例（%）]表示，采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier繪制生存曲線，行Log-rank檢驗進行生存分析；采用Cox比例風險模型分析影響肝癌患者術后預后的相關因素。以Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NY-ESO-1在不同肝組織中的表達情況 HCC組NY-ESO-1蛋白表達陽性率高達21.13%，顯著高于癌旁組、正常組，差異均有統計學意義（χ2=16.772、5.867），見表1。

2.2 NY-ESO-1蛋白表達與HCC患者臨床病理特征的關系 NY-ESO-1蛋白陽性表達患者中腫瘤直徑≥ 5 cm、Ⅱ a ～ Ⅱ b分期、Edmondson分級Ⅲ/Ⅳ級、Ki-67高表達、MVI為M1/2級患者占比均顯著高于NY-ESO-1蛋白陰性表達患者，差異均有統計學意義（均Plt;0.05），見表2。

2.3 不同NY-ESO-1表達情況HCC患者生存分析 截止隨訪結束，陽性組患者存活率為38.46%，陰性組患者存活率為53.72%，陽性組顯著低于陰性組，差異有統計學意義（χ2=4.322， Plt;0.05），見圖1。

2.4 影響HCC患者預后的單因素分析 單因素分析結果顯示，腫瘤直徑≥ 5 cm、Ⅱ a ～ Ⅱ b分期、Edmondson分級Ⅲ/Ⅳ級、Ki-67高表達、MVI為M1/2級、NY-ESO-1陽性均是影響HCC患者預后的相關因素，差異均有統計學意義（均Plt;0.05），見表3。

2.5 影響HCC患者預后的Cox回歸模型多因素分析 將單因素分析中差異有統計學意義的因素納入Cox比例風險回歸模型進行多因素分析，結果顯示，腫瘤直徑≥ 5 cm、Ⅱ a ～ Ⅱ b分期、Edmondson分級Ⅲ/Ⅳ級、Ki-67高表達、MVI為M1/2級、NY-ESO-1陽性均是影響HCC患者預后的危險因素（HR=4.106、2.184、5.579、13.967、3.296、2.735），差異均有統計學意義（均Plt;0.05），見表4。

3 討論

HCC是指來源于肝的上皮組織的一種惡性的腫瘤，發生原因可能是由于慢性病毒性肝炎反復不愈，也可能是由于常年進食被黃曲霉素污染的食物而出現了惡變。長期飲酒的患者也會出現酒精性肝硬化和肝癌的發生，患者有明顯的疼痛、乏力、食欲下降，檢查甲胎蛋白測定偏高，會有鞏膜黃染及貧血，深入研究HCC相關的風險因素對其治療有重要意義[8]。

腫瘤細胞產生的NY-ESO-1蛋白能夠誘導細胞毒性T淋巴細胞應答，起到殺傷腫瘤細胞的作用，細胞毒性T淋巴細胞能夠識別組織相溶性抗原（HLA）-A2限制性NY-ESO-1157-165抗原肽，從而使NY-ESO-1呈陽性的腫瘤細胞被有效清除，因此NY-ESO-1在未來腫瘤輔助治療，尤其是免疫治療方面有重要應用前景[9-10]。NY-ESO-1作為免疫原性很強的腫瘤抗原于多種腫瘤細胞中有表達，但表達比例有所不同，在正常組織僅表達于睪丸組織[11-12]；且殷波等[13]研究報道，NY-ESO-1在膀胱移行細胞癌組織中有較高表達，其表達率隨著腫瘤分級的升高而升高，而在癌旁組織無表達。本研究結果亦顯示，對于HCC患者，NY-ESO-1蛋白僅表達于HCC肝癌組織中，陽性表達率高達21.13%，而在癌旁組織與正常肝臟組織中無表達，提示NY-ESO-1僅在HCC中表達，在癌旁組織與正常肝組織中不表達。孫發政等[14]研究報道，NY-ESO-1在臨床分期早、分化程度高、無淋巴結轉移的肺癌組織中表達率較高，提示NY-ESO-1與肺癌患者臨床病理特征密切相關。本研究也進一步分析了NY-ESO-1蛋白表達與HCC患者臨床病理特征的關系，結果顯示，NY-ESO-1蛋白陽性表達患者中腫瘤直徑≥ 5 cm、Ⅱ a ～ Ⅱ b分期、Edmondson分級Ⅲ/Ⅳ級、Ki-67高表達、MVI為M1/2級的患者占比均顯著高于NY-ESO-1蛋白陰性表達患者，提示NY-ESO-1與HCC患者臨床病理特征密切相關，有望將其作為臨床對HCC患者病情評估，以及癌組織特異性免疫治療的靶分子、判斷預后的指標。

腫瘤直徑是腫瘤的生物學特性之一，腫瘤直徑從另一方面反映了腫瘤的生長速度，當腫瘤直徑變大即瘤體體積增大時，提示腫瘤增長速度加快，腫瘤增大會加速破壞包膜，使包膜不完整，容易導致血管侵犯并發生肝內轉移，甚至會影響肝癌的治療效果與預后[15]；CNLC分期是結合患者自身情況、腫瘤情況等綜合因素制定的適合中國人的肝癌分期方案，結合肝癌的一般規律，分期越晚，預后越差；在肝細胞癌中最經典和最常用的分級系統為Edmondson分級，其中分級越高代表分化程度越低，腫瘤的分化程度可以體現出其增殖性和侵襲性，其與患者預后密切相關[16]；Ki-67是一種存在于增殖細胞中的核抗原，與細胞的有絲分裂過程密切相關，在細胞周期的G2期和M期表達最高，而G0期不表達，以此可以識別正常分裂的細胞和腫瘤細胞，并可作為判斷患者預后的有效指標[17]；MVI作為判斷肝癌術后遠期生存的重要指標，可通過門靜脈或肝動脈分支導致肝內腫瘤復發或遠處轉移，進而縮短患者術后的遠期生存時間，影響預后[18]；李鳳蓮等[19]研究報道，乳腺髓樣癌患者中NY-ESO-1陰性表達患者病死率顯著低于NY-ESO-1陽性表達患者；且邱婷婷[20]報道顯示，NY-ESO-1陽性表達是上皮性卵巢癌患者預后的危險因素。本研究中Cox回歸模型分析顯示，腫瘤直徑≥ 5 cm、Ⅱ a ～ Ⅱ b分期、Edmondson分級Ⅲ/Ⅳ級、Ki-67高表達、MVI M1/2級、NY-ESO-1陽性均是影響HCC患者預后的危險因素。因此臨床應針對上述因素及時進行監測，并給予對應的干預措施，改善HCC患者預后。

綜上，NY-ESO-1在HCC組織中呈高表達，且腫瘤直徑≥ 5 cm、Ⅱ a ～ Ⅱ b分期、Edmondson分級Ⅲ/Ⅳ級、Ki-67高表達、MVI M1/2級、NY-ESO-1陽性均是影響HCC患者預后的危險因素，臨床上可針對上述因素采取相應措施，改善患者預后。

參考文獻

趙靈利， 王磊， 張裕， 等. 血清γ-谷氨酰轉肽酶及甲胎蛋白對肝動脈化療栓塞術治療原發性肝癌患者預后的影響[J]. 臨床誤診誤治， 2022， 35（6）： 59-63.

周正， 馮青青. 非小細胞肺癌腦轉移與血清腫瘤標志物變化的相關性分析[J]. 中國實用神經疾病雜志， 2019， 22（19）： 2097-2103.

劉凱， 陳婷， 閆超， 等. 食管鱗癌NY-ESO-1、SSX-2和MAGE-A3的特異性CTL免疫反應[J]. 新疆醫科大學學報， 2018， 41（8）： 925-932.

劉靜維， 盧戌， 楊照敏， 等. 負載NY-ESO-1多肽的樹突狀細胞激發特異性細胞毒性T淋巴細胞反應[J]. 北京大學學報（醫學版）， 2017， 49（5）： 840-846.

馮秀榮， 田華， 陳光福， 等. 肝功能四項指標變化與肝炎肝硬化患者Child-Pugh分級的關聯性[J]. 河南醫學研究， 2021， 30（15）： 2857-2859.

中國抗癌協會肝癌專業委員會， 中國抗癌協會臨床腫瘤學協作委員會， 中華醫學會肝病學分會肝癌學組. 原發性肝癌規范化診治專家共識[J]. 臨床腫瘤學雜志， 2009， 14（3）： 259-269.

張陽德， 任菲， 彭健. 人類NY-ESO-1基因編碼在肝癌中的表達[J]. 中國現代醫學雜志， 2013， 23（6）： 1-7.

杜國智， 宋彬， 楊衛東， 等. 基于CT的影像組學聯合血清甲胎蛋白水平預測肝癌病理分級的價值[J]. 中國醫學裝備， 2021， 18（6）： 68-71.

彭裕輝， 翁雪芬， 張利群， 等. 腫瘤自身抗體NY-ESO-1和PRDX6聯合熱休克蛋白70檢測對肺癌的診斷價值[J]. 中華實用診斷與治療雜志， 2015， 29（10）： 1024-1027.

徐珩. HLA-A2限制性NY-ESO-1抗原特異的TCR基因轉導人外周血T淋巴細胞過繼免疫治療肝癌的初步研究[D]. 合肥： 安徽醫科大學， 2010.

趙松， 耿煒， 郝軍， 等. 腫瘤 - 睪丸抗原SSX、NY-ESO-1、MAGE-A1在胰腺癌中的表達及其生物學意義[J]. 解剖學報， 2012， 43（1）： 53-58.

馬鳴， 焦文靜， 張金艷. NY-ESO-1在腫瘤中的表達及其臨床意義研究進展[J]. 國際檢驗醫學雜志， 2015， 36（21）： 3138-3141.

殷波， 國宏志， 張墨， 等. NY-ESO-1在膀胱移行細胞癌組織中的表達及臨床意義[J]. 現代腫瘤醫學， 2014， 22（7）： 1624-1626.

孫發政， 萬國峰， 肖欣. NY-ESO-1和MAGE-A1蛋白在肺癌中的表達及臨床意義[J/CD]. 中華臨床醫師雜志（電子版）， 2012， 6（24）： 8315-8317.

孔杰， 李輝， 曾雪燕， 等. 原發性肝癌區域淋巴結轉移的臨床病理特點及預后分析[J]. 中華腫瘤防治雜志， 2022， 29（4）： 290-295， 301.

郭佳， 田洲， 顧娜，等. 轉染NY-ESO-1特異性TCR增強人PBMC對NY-ESO-1陽性腫瘤細胞的特異性細胞毒性[J]. 基礎醫學與臨床， 2013， 33（3）： 303-307.

李長賢， 張慧， 吳曉峰， 等. 不同中國肝癌分期肝癌根治性切除術后的臨床效果及預后因素分析[J]. 中華外科雜志， 2021， 59（2）： 134-143.

司安鋒， 黃鑫， 雷正清， 等. 微血管侵犯對肝癌肝移植患者預后的影響[J]. 臨床腫瘤學雜志， 2020， 25（4）： 316-321.

李鳳蓮， 桑梅香. MAGE-A家族與NY-ESO-1在乳腺癌中的表達及免疫治療前景[J]. 標記免疫分析與臨床， 2016， 23（12）： 1468-1472.

邱婷婷. NY-ESO-1和MAGE-A1在上皮性卵巢癌中的表達及其意義[D]. 南昌： 南昌大學， 2017.