抗壞血酸引發對燕麥老化種子胚細胞抗氧化性能的影響

摘要：本研究探討了外源抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）引發對燕麥（Avena sativa）老化種子胚細胞抗氧化性能的影響，以期為貯藏種子的科學利用提供理論依據。試驗以老化20 d的燕麥種子為材料，用濃度為0.5，1.5和2.5 mmol·L-1的外源AsA引發0（CK），4，8，16和24 h后，分析其種胚細胞抗氧化酶活性及脂質過氧化水平的變化規律。結果表明：外源AsA引發下燕麥老化種子胚細胞的丙二醛含量顯著低于CK（Plt;0.05），而其各抗氧化酶的活性顯著高于CK（Plt;0.05）。低濃度（0.5 mmol·L-1）外源AsA引發24 h時，燕麥老化種子胚細胞內各抗氧化酶活性顯著高于其他引發時間（Plt;0.05），但高濃度（1.5和2.5 mmol·L-1）外源AsA引發24 h時，燕麥老化種子胚細胞內抗氧化酶活性均顯著下降（Plt;0.05），且其丙二醛含量上升。綜上所述，外源AsA引發對燕麥老化種子胚細胞的抗氧化性能的影響與其濃度和引發時間密切相關，0.5 mmol·L-1的AsA引發24 h是提高燕麥老化種子胚細胞抗氧化性能的最佳處理。

關鍵詞：抗壞血酸；種子引發；種子老化；燕麥；抗氧化性能

中圖分類號：S512.6 文獻標識碼：A 文章編號：1007-0435（2023）08-2392-07

Effect of AsA Priming on the Oxidation Resistance of Embryonic

Cells of Aged Oat Seeds

LI Hong-yu1，2， WANG Cong-cong1， XIA Fang-shan1*， YANG Xuan1， LI Yin-lin1， ZHANG Jie-min1

（1. College of Grassland Science， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China; 2. Office of Research

Administration， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China）

Abstract：To provide a theoretical basis for the scientific utilization of stored seeds，the study examined the influence of exogenous ascorbic acid （AsA） priming on the antioxidant properties in embryonic cells of aged oat （Avena sativa） seeds. Oat seeds were aged for 20 d as the experimental materials，and then primed with 0.5，1.5 and 2.5 mmol·L-1 AsA for 0 （the control），4，8，16 and 24 h，and the activities of antioxidant enzymes and lipid peroxidation in their embryonic cells were tested. The results showed that the malondialdehyde contents of the embryonic cells of aged oat seeds undergone AsA priming were significantly lower than that of CK （Plt;0.05），but the activities of antioxidant enzymes were significantly higher than that of CK （Plt;0.05）. Low concentration （0.5 mmol·L-1） AsA primed for 24 h，the activities of antioxidant enzymes in embryonic cells of aged oat seeds were significantly higher than those of other priming times. However，the activities of antioxidant enzymes decreased significantly in embryonic cells of aged oat seeds undergone a high concentration （1.5 and 2.5 mmol·L-1） AsA primed for 24 h （Plt;0.05），and their malondialdehyde contents were also increased. In conclusion，the influence of exogenous AsA priming on the antioxidant properties of embryonic cells of aged oat seeds was closely related to the AsA concentration and priming time，and priming with 0.5 mmol·L-1 AsA for 24 was the best treatment to improve the antioxidant properties of embryonic cells of aged oat seeds.

Key words：Ascorbic acid;Seed priming;Seed ageing;Oat;Oxidation resistance

種子活力會直接影響植物的種子萌發、幼苗生長及作物產量，因而其水平高低成為決定農業生產成敗的關鍵因素［1］。種子活力即使在最佳貯藏狀態下也會逐漸出現不可逆的下降現象［2］，從而限制了現代化農業的高質量發展步伐。此外，種子貯藏過程的活力喪失還會導致其遺傳完整性被破壞，從而不利于植物種質資源的長期保存［3］。活性氧（Reactive oxygen species，ROS）自由基在貯藏過程中的過量積累是造成種子活力下降的主要原因［4］，其可與細胞內所有大分子有機物質發生生物化學反應，并導致蛋白質損傷、脂質過氧化、染色體異常和DNA變異等各類細胞組分的破壞［1］。H2O2是動植物體內調節ROS動態平衡網絡的核心因子，其含量高低與種子活力水平下降快慢有密切關系［5-6］。研究發現，高濃度（≥3.84 mol·L-1）或長時間（≥12 h）外源H2O2引發均會導致燕麥（Avena sativa）種胚細胞及線粒體內超氧化超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（Catalase，CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）、單脫氫抗壞血酸還原酶（Monodehydroasorbate reductase，MDHAR）、脫氫抗壞血酸還原酶（Dehydroascorbate reductase，DHAR）和谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR）活性降低，并導致兩者H2O2和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量升高，從而導致其種子活力出現嚴重下降，甚至完全喪失的現象［7-9］。相似地，燕麥種子老化研究中也發現了相同的現象［10-11］。因此，如何最大限度地提高老化種子內抗氧化能力是改善種子活力水平的關鍵所在，這也就成為了當前種子科學領域研究的熱點問題之一。

適宜的引發處理是緩解種子老化影響的最經濟有效的技術手段，能夠促進老化種子的貯藏物質代謝，提高其抗氧化酶活性，降低其脂質過氧化作用，從而提升其萌發能力［12-13］。抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）是動植物體內普遍存在的一種重要的抗氧化物質，可以通過促進酶促和非酶促抗氧化作用，有效清除動植物體內產生的ROS［14］。研究發現，種子內AsA對其老化過程中ROS的清除具有重要作用，但其含量會在此過程中逐漸減少［10-11，15］。因此，外源AsA處理成為提高老化種子活力的重要方法，目前已在老芒麥（Elymus sibiricus）［16］、梭梭（Haloxylon ammodendron）［17］、無芒雀麥（Bromus inermis）［18］和草地早熟禾（Poa pratensis）［19］等牧草的老化種子中有研究報道。外源AsA處理能夠通過提高植物體內主要抗氧化酶活性，從而增強植物耐鹽［20-21］、耐砷［22］、耐旱［23］、抗病［24］及耐老化［25］等適應逆境條件的生長發育能力。然而，外源AsA引發提高老化種子活力的內在機制仍然不清楚。因此，本試驗旨在探討外源AsA引發對燕麥種胚細胞抗氧化性能的影響，以期為揭示外源AsA提高老化種子活力的機理研究提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試燕麥品種為‘太陽神’，種子于2019年6月購自北京正道農業股份有限公司，其初始發芽率99%，初始含水量7.2%（鮮重基礎）。種子獲得后，在—20℃條件保存至2020年5月開始試驗。

1.2 種子處理

將種子去除稃殼后，參照劉備等［26］的方法將其含水量調整至10%（鮮重基礎），迅速用鋁箔袋分裝（每袋約10 g左右）后密封，并置于45℃恒溫水浴鍋內進行老化處理20 d后取出（種子發芽率降至約75%）。用濃度為0.5，1.5和2.5 mmol·L-1（從0，0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 mmol·L-1濃度中篩選出）的AsA溶液分別引發0（CK），4，8，16和24 h后，立即用蒸餾水沖洗3遍，用濾紙吸干種子表面水分后，放在25℃黑暗環境中回干至引發前種子含水量，最后置于4℃冰箱中密封保存備用。

1.3 測定指標及方法

用蒸餾水在室溫條件下吸脹4 h（胚根未突破種皮）后，剝取100個種胚進行冰浴研磨，具體參照Kibinza等［27］的方法提取粗酶液，每個處理重復4次。SOD活性測定參照Rao等［28］的方法，CAT活性測定參照Clairbone［29］的方法，APX和DHAR活性測定參照Nakano等［30］的方法，MDHAR活性測定參照Arrigoni等［31］的方法，GR活性測定參照Esterbauer等［32］的方法，MDA含量測定參照Bailly等［33］的方法，上述指標計算所需的可溶性蛋白含量則采用購自南京建成生物工程研究所的試劑盒進行測定。

1.4 數據分析

試驗數據采用Excel 2010和SPSS 21.0統計分析軟件進行數據整理和方差分析，之后用Duncans法（P＜0.05）進行多重比較，結果以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 外源AsA引發對燕麥種胚細胞SOD活性的影響

由圖1可知，外源AsA引發濃度為0.5 mmol·L-1時，燕麥種胚細胞SOD活性隨著引發時間的延長而逐漸升高，并在引發24 h時顯著高于其他引發時間（Plt;0.05）；外源AsA引發濃度為1.5 mmol·L-1和2.5 mmol·L-1時，燕麥種胚細胞SOD活性隨著引發時間的延長呈現先升高后下降的趨勢。引發4 h和8 h時，燕麥種胚細胞SOD活性均隨著AsA濃度的增加而升高；引發16 h時，燕麥種胚細胞SOD活性隨著AsA濃度的增加呈先升高后下降的趨勢，在濃度為1.5 mmol·L-1時顯著高于其他濃度引發時（Plt;0.05）；引發24 h時，燕麥種胚細胞SOD活性隨著AsA濃度的增加而下降，在濃度為0.5 mmol·L-1時顯著高于其他濃度引發時（Plt;0.05），而在濃度為2.5 mmol·L-1時顯著低于其他濃度引發時（Plt;0.05）。

2.2 外源AsA引發對燕麥種胚細胞CAT活性的影響

由圖2可知，外源AsA引發濃度為0.5 mmol·L-1時，燕麥種胚細胞CAT活性隨著引發時間的延長而逐漸升高，并在引發24 h時顯著高于其他引發時間（Plt;0.05）；外源AsA引發濃度為1.5 mmol·L-1和2.5 mmol·L-1時，燕麥種胚細胞CAT活性隨著引發時間的延長呈現先升高后下降的趨勢，用1.5 mmol·L-1的AsA引發16 h時顯著高于引發0 h（CK）～8 h（Plt;0.05），用2.5 mmol·L-1的AsA引發8 h時顯著高于其他引發時間（Plt;0.05），而用2.5 mmol·L-1的AsA引發24 h時顯著低于引發4 h～16 h時（Plt;0.05）。引發4 h時，燕麥種胚細胞CAT活性隨著AsA濃度的增加而升高，在濃度為0.5 mmol·L-1時顯著低于其他濃度引發時（Plt;0.05）；引發8 h時，燕麥種胚細胞CAT活性隨著AsA濃度的增加呈先升高后下降的趨勢，在濃度為1.5 mmol·L-1時顯著高于其他濃度引發時（Plt;0.05）；引發16 h時，燕麥種胚細胞CAT活性隨著AsA濃度的增加而下降，在濃度為2.5 mmol·L-1時顯著低于其他濃度引發時（Plt;0.05）；引發24 h時，燕麥種胚細胞CAT活性隨著AsA濃度的增加而下降，在濃度為0.5 mmol·L-1時顯著高于其他濃度引發時（Plt;0.05），而在濃度為2.5 mmol·L-1時顯著低于其他濃度引發時（Plt;0.05）。

2.3 外源AsA引發對燕麥種胚細胞APX活性的影響

由圖3可知，外源AsA引發濃度為0.5 mmol·L-1時，燕麥種胚細胞APX活性隨著引發時間的延長而逐漸升高，并在引發24 h時顯著高于其他引發時間（Plt;0.05）；外源AsA引發濃度為1.5 mmol·L-1和2.5 mmol·L-1時，燕麥種胚細胞APX活性隨著引發時間的延長呈現先升高后下降的趨勢，用1.5 mmol·L-1的AsA引發16 h時顯著高于其他引發時間（Plt;0.05），用2.5 mmol·L-1的AsA引發16 h時顯著高于引發0 h（CK）～8 h（Plt;0.05）。引發4 h時，燕麥種胚細胞APX活性隨著AsA濃度的增加而升高，在濃度為2.5 mmol·L-1時顯著高于其他濃度引發時（Plt;0.05）；引發8 h和16 h時，燕麥種胚細胞APX活性均隨著AsA濃度的增加呈先升高后下降的趨勢，并均在濃度為1.5 mmol·L-1時顯著高于其他濃度引發時（Plt;0.05）；引發24 h時，燕麥種胚細胞APX活性隨著AsA濃度的增加而下降，在濃度為0.5 mmol·L-1時顯著高于其他濃度引發時（Plt;0.05），而在濃度為2.5 mmol·L-1時顯著低于其他濃度引發時（Plt;0.05）。

2.4 外源AsA引發對燕麥種胚細胞MDHAR活性的影響

由圖4可知，外源AsA引發濃度為0.5 mmol·L-1時，燕麥種胚細胞MDHAR活性隨著引發時間的延長而逐漸升高，并在引發24 h時顯著高于其他引發時間（Plt;0.05）；外源AsA引發濃度為1.5 mmol·L-1和2.5 mmol·L-1時，燕麥種胚細胞MDHAR活性隨著引發時間的延長呈現先升高后下降的趨勢，并均在引發16 h時顯著高于其他引發時間（Plt;0.05），但引發4 h～24 時均顯著高于引發0 h（CK）。引發4 h時，燕麥種胚細胞MDHAR活性隨著AsA濃度的增加而升高，在濃度為0.5 mmol·L-1時顯著低于其他濃度引發時（Plt;0.05）；引發8 h時，燕麥種胚細胞MDHAR活性也隨著AsA濃度的增加而升高，但各濃度間無顯著差異；引發16 h時，燕麥種胚細胞MDHAR活性隨著AsA濃度的增加呈先升高后下降的趨勢，在濃度為1.5 mmol·L-1時顯著高于其他濃度引發時（Plt;0.05）；引發24 h時，燕麥種胚細胞MDHAR活性隨著AsA濃度的增加而下降，在濃度為0.5 mmol·L-1時顯著高于其他濃度引發時（Plt;0.05），而在濃度為2.5 mmol·L-1時顯著低于其他濃度引發時（Plt;0.05）。

2.5 外源AsA引發對燕麥種胚細胞DHAR活性的影響

由圖5可知，外源AsA引發濃度為0.5 mmol·L-1時，燕麥種胚細胞DHAR活性隨著引發時間的延長而顯著升高（Plt;0.05），并在引發24 h時顯著高于其他引發時間（Plt;0.05）；外源AsA引發濃度為1.5 mmol·L-1和2.5 mmol·L-1時，燕麥種胚細胞DHAR活性隨著引發時間的延長呈現先升高后下降的趨勢，用1.5 mmol·L-1的AsA引發16 h時顯著高于引發0 h （CK）～8 h（Plt;0.05），用2.5 mmol·L-1的AsA引發8 h時顯著高于其他引發時間（Plt;0.05）。引發4 h時，燕麥種胚細胞DHAR活性隨著AsA濃度的增加而升高，在濃度為2.5 mmol·L-1時顯著高于其他濃度引發時（Plt;0.05）；引發8 h時，燕麥種胚細胞DHAR活性也隨著AsA濃度的增加而升高，在濃度為0.5 mmol·L-1時顯著低于其他濃度引發時（Plt;0.05）；引發16 h時，燕麥種胚細胞DHAR活性隨著AsA濃度的增加而下降，在濃度為2.5 mmol·L-1時顯著低于其他濃度引發時（Plt;0.05）；引發24 h時，燕麥種胚細胞DHAR活性也隨著AsA濃度的增加而下降，在濃度為0.5 mmol·L-1時顯著高于其他濃度引發時（Plt;0.05），而在濃度為2.5 mmol·L-1時顯著低于其他濃度引發時（Plt;0.05）。

2.6 外源AsA引發對燕麥種胚細胞GR活性的影響

由圖6可知，外源AsA引發濃度為0.5 mmol·L-1時，燕麥種胚細胞GR活性隨著引發時間的延長而逐漸升高，并在引發24 h時顯著高于其他引發時間（Plt;0.05）；外源AsA引發濃度為1.5 mmol·L-1和2.5 mmol·L-1時，燕麥種胚細胞GR活性隨著引發時間的延長呈現先升高后下降的趨勢，并均在引發16 h時顯著高于其他引發時間（Plt;0.05）。引發4 h時，燕麥種胚細胞GR活性隨著AsA濃度的增加而升高，在濃度為2.5 mmol·L-1時顯著高于濃度為0.5 mmol·L-1時（Plt;0.05）；引發8 h時，燕麥種胚細胞GR活性隨著AsA濃度的增加呈先升高后下降的趨勢，在濃度為1.5 mmol·L-1時顯著低于其他濃度引發時（Plt;0.05）；引發16 h時，燕麥種胚細胞GR活性隨著AsA濃度的增加而下降，在濃度為2.5 mmol·L-1時顯著低于其他濃度引發時（Plt;0.05）；引發24 h時，燕麥種胚細胞GR活性也隨著AsA濃度的增加而下降，在濃度為0.5 mmol·L-1時顯著高于其他濃度引發時（Plt;0.05），而在濃度為2.5 mmol·L-1時顯著低于其他濃度引發時（Plt;0.05）。

2.7 外源AsA引發對燕麥種胚細胞MDA含量的影響

由圖7可知，外源AsA引發濃度為0.5 mmol·L-1時，燕麥種胚細胞MDA含量隨著引發時間的延長而逐漸下降，并在引發24 h時顯著低于其他引發時間（Plt;0.05）；外源AsA引發濃度為1.5 mmol·L-1和2.5 mmol·L-1時，燕麥種胚細胞MDA含量隨著引發時間的延長呈現先下降后升高的趨勢，用1.5 mmol·L-1的AsA引發16 h時顯著低于其他引發時間（Plt;0.05），用2.5 mmol·L-1的AsA引發16 h時顯著低于引發0 h（CK）～4 h和24 h（Plt;0.05）。引發4 h時，燕麥種胚細胞MDA含量隨著AsA濃度的增加而下降，但各濃度間無顯著差異；引發8 h時，燕麥種胚細胞MDA含量也隨著AsA濃度的增加而下降，但在濃度為2.5 mmol·L-1時顯著低于其他濃度引發時（Plt;0.05）；引發16 h時，燕麥種胚細胞MDA含量隨著AsA濃度的增加呈先下降后升高的趨勢，在濃度為1.5 mmol·L-1時顯著低于其他濃度引發時（Plt;0.05）；引發24 h時，燕麥種胚細胞MDA含量隨著AsA濃度的增加而升高，在濃度為0.5 mmol·L-1時顯著低于其他濃度引發時（Plt;0.05），而在濃度為2.5 mmol·L-1時顯著高于其他濃度引發時（Plt;0.05）。

3 討論

抗氧化酶系統是植物細胞內維持ROS動態平衡的重要清除劑，可緩解種子老化過程中ROS過量積累對細胞膜系統的攻擊，延緩其細胞膜系統脂質過氧化損傷的發生，進而降低種子活力喪失的速度［34-35］。然而，種子內抗氧化酶活性會隨著老化程度的加劇而不斷降低，致使種子細胞因過量積累ROS而遭受脂質過氧化損傷，這是造成老化種子活力喪失的主要原因［5-6］。AsA是抗壞血酸-谷胱甘肽循環中2個重要的抗氧化物質之一，在維持細胞內ROS平衡方面發揮著關鍵作用［14］，因而外源AsA處理能夠顯著提高老化種子細胞內SOD，CAT和過氧化物酶的活性（Plt;0.05），并顯著降低了其MDA含量（Plt;0.05），從而使其種子活力得到改善［17-18］。本試驗發現，除濃度為0.5 mmol·L-1的AsA引發4 h時外，外源AsA引發顯著提高了老化燕麥種胚細胞SOD，CAT，APX，MDHAR，DHAR和GR活性（Plt;0.05），并顯著降低了其MDA含量（Plt;0.05），這說明外源AsA引發提高了老化燕麥種胚細胞的抗氧化能力，從而緩解了其細胞膜系統脂質過氧化作用的產生，進而使其種子活力得到明顯提升［36］，這與在梭梭［17］和無芒雀麥［18］老化種子中的發現相似，這可能是引發使外源AsA在修復前進入被損傷的細胞內部，并激活了抗壞血酸-谷胱甘肽循環等代謝反應中的關鍵酶活性，從而修復了種子老化過程中ROS過量積累造成的脂質過氧化損傷［18］。

外源物質的引發處理往往會產生雙重效應［8-9］。外源引發物質的濃度和引發時間是種子引發處理中的關鍵因素，一般低濃度或短時間的引發會產生有益的影響，而高濃度或長時間引發往往會產生不利的影響［37-38］。本試驗發現，0.5 mmol·L-1的AsA引發時，老化燕麥種胚細胞內SOD，CAT，APX，MDHAR，DHAR和GR活性均隨著引發時間的延長而升高，其MDA含量則呈相反的趨勢，而高濃度（1.5 mmol·L-1和2.5 mmol·L-1）AsA引發時，老化燕麥種胚細胞內SOD，CAT，APX，MDHAR，DHAR和GR活性均隨著引發時間的延長而呈先升高后降低的趨勢，其MDA含量也呈相反的趨勢，這說明外源AsA引發對老化燕麥種胚細胞抗氧化性能的影響也受其濃度和引發時間的影響。這與在梭梭［17］老化種子中的研究發現相似。AsA通過增強酶促或非酶促抗氧化途徑的作用來有效清除脅迫產生的ROS［39］，但低濃度（0.5 mmol·L-1）AsA引發對種胚細胞產生的影響往往需要的時間更長，因而短時間（4 h）引發時僅有SOD，CAT和DHAR活性顯著提高（Plt;0.05）。相反，高濃度（2.5 mmol·L-1）對種胚細胞產生的影響所需要的時間就會大大縮短，也更容易使其所需的AsA達到飽和狀態，長時間（16 h～24 h）引發時就會對老化燕麥種胚細胞產生水勢脅迫，從而使種胚細胞出現不利影響［40］，表現為抗氧化性能的降低和脂質過氧化作用的增強。因此，適宜的AsA濃度和引發時間是提高老化燕麥種胚細胞抗氧化性能的關鍵。本試驗中，0.5 mmol·L-1的AsA引發24 h時，老化燕麥種胚細胞內SOD，CAT，APX，MDHAR，DHAR和GR活性最高，而其MDA含量則最低，這說明0.5 mmol·L-1的AsA引發24 h是提高老化燕麥種胚細胞抗氧化性能的最佳引發處理。

4 結論

外源AsA引發對老化燕麥種胚細胞的抗氧化性能的影響與其濃度和引發時間有密切關系。除高濃度（1.5 mmol·L-1和2.5 mmol·L-1）外源AsA長時間（≥16 h）引發外，外源AsA引發會提高老化燕麥種胚細胞的抗氧化性能，并降低其脂質過氧化作用，其中0.5 mmol·L-1的AsA引發24 h是提高老化燕麥種胚細胞抗氧化性能的最佳引發處理。

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（責任編輯 閔芝智）

收稿日期：2023-02-20；修回日期：2023-03-29

基金項目：山西農業大學“十四五”生物育種工程項目（YZGC134）；國家自然基金項目（31702171）；內蒙古大學“省部共建草原家畜生殖調控與繁育”國家重點實驗室開放課題（2021KF0303）；山西省重點研發計劃項目（202102140601006）資助

作者簡介：李紅玉（1973-），女，漢族，山西太谷人，高級實驗師，碩士，主要從事草類植物育種與種子科學研究，E-mail：lihongyu289@126.com；*通信作者Author for correspondence，E-mail：dqlxfs8583@163.com