HPLC法測定坤寧顆粒中柚皮苷的含量

程盟玲，何 鵬

(蕪湖市食品藥品檢驗中心，蕪湖 241000)

坤寧顆粒是由益母草、當歸、赤芍、丹參、枳殼等 11 味中藥加一定的賦形劑，經提取、濃縮、干燥后制成的具有活血行氣、止血調經功效的中藥顆粒劑[1]。對于婦女氣滯血瘀，出現月經過多、經期延長等臨床癥狀者，坤寧顆粒能明顯縮短出血時間，具有很好的促凝作用，集調經和止血于一體，既治標又治本，達到止血調經的效果。研究表明，坤寧顆粒中有四百多種成分，而其發揮抗凝血活性的 Q-Marker以及治療異常子宮出血的物質基礎可能就是芍藥苷、丹酚酸B、新橙皮苷及柚皮苷等成分[2]。丹酚酸B來自丹參，芍藥苷來自赤芍，新橙皮苷與柚皮苷均出自枳殼。枳殼作為臣藥，用量較大，而目前該顆粒的質量標準為YBZ10452005-2015Z，主要控制組方中赤芍的芍藥苷含量，輔以橙皮苷、鹽酸水蘇堿等成分對枳殼、益母草等藥味進行定性鑒別，均沒有對枳殼的有效成分如橙皮苷、柚皮苷等進行含量監測[3]。為了對坤寧顆粒的質量進行更好的監測，本文建立HPLC方法，以柚皮苷計測定枳殼的含量，判斷坤寧顆粒中枳殼藥材的真偽優劣。該方法操作簡單易學，速度快，重現性好，具有很強的實用性。

1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：島津LC-20AT；PDA檢測器：島津SPD-M40；分析天平：梅特勒-托利多XP205、梅特勒-托利多ME36S；水為超純水；乙腈為色譜純，甲醇以及磷酸為分析純；柚皮苷對照品：中檢院，110722-202116，含量以93.5%計；坤寧顆粒樣品：藥房購買，生產廠家為合肥立方制藥股份有限公司，每袋裝 15 g，批號220109、220701、2208011、2209009。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：島津SHIMSEN Ankylo C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；波長：283 nm；以乙腈-0.1%磷酸溶液(0～25 min：16∶84；25～27 min：16～35∶84～65；27～32 min：36∶65)為流動相；流速：1.0 mL/min；進樣體積：10 μL。

2.2 對照品溶液的制備

取柚皮苷對照品適量，精密稱定，加80%甲醇制成 25.67 μg/mL 的溶液，即得。

2.3 供試品溶液的制備

精密稱取研細后的樣品粉末 1 g，置錐形瓶中，精密加入80%甲醇 50 mL，稱重，超聲(功率 200 W，頻率 30 kHz)30 min，冷卻后稱重，用80%甲醇補足減少的質量，過濾，取過濾液，即得。

2.4 試驗與結果

2.4.1 重復性試驗

取同一批號(220109)坤寧顆粒，按“2.3”制備6份供試品溶液，按“2.1”分別測定，計算柚皮苷的含量，RSD=0.9%，該方法重復性良好，符合檢測需求。試驗結果見表1。

表1 重復性試驗結果

2.4.2 精密度試驗

取“2.2”項下對照品溶液，按“2.1”連續測定6 次，記錄柚皮苷峰面積值，RSD=0.3%，儀器精密度較好，符合檢測需求。結果見表2。

表2 對照品溶液的精密度試驗結果

2.4.3 線性

取柚皮苷對照品，精密稱取 10.98 mg，置 100 mL 容量瓶中，加80%甲醇溶解至刻度，搖勻，作為對照品儲備液。精密吸取對照品儲備液，按照表3方法制成6種質量濃度的對照品溶液；取上述6種對照品溶液，按“2.1”分別測定，以質量濃度(μg/mL)為橫坐標，峰面積值為縱坐標，作標準曲線，柚皮苷在5.13～102.66 μg/mL 范圍內具有良好的線性關系[4]。回歸方程為Y=15223.662X+2947.521，R2=1.000。結果見表3、圖1。

圖1 標準曲線圖

表3 標準曲線數據

2.4.4 加樣回收試驗

取已知含量(批號220109，質量分數為 1.52 mg/g)的坤寧顆粒，研細，取樣品 1 g，對照品 3 mg，精密稱定，置同一具塞錐形瓶中，按“2.3”平行制備6份加標溶液，按“2.1”分別測定，計算加樣回收率，結果RSD=1.3%，本方法具有良好的回收率，符合檢測需求。試驗結果見表4。

表4 回收試驗結果

計算公式：

(1)

2.4.5 專屬性試驗

陰性對照液的制備：取坤寧顆粒組方除枳殼外其他藥味，按照坤寧顆粒工藝方法，制成陰性樣品，取該樣品1 g，按“2.3”制備陰性對照液。

取“2.2”項下的對照品溶液、陰性對照液和“2.1”項下1號供試品溶液，按“2.1”分別測定[5]。結果表明，在同一保留時間，供試品與對照品色譜均出現色譜峰，在相應位置上，陰性對照色譜未出現色譜峰。表明其他藥味中的成分對測定柚皮苷無干擾作用。色譜圖見圖2。

圖2 HPLC色譜圖

2.4.6 穩定性試驗

取坤寧顆粒樣品，按“2.3”制成1份供試品溶液，分別測定并記錄 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 時供試品中的柚皮苷峰面積值，結果RSD=0.3%，表面供試品溶液中的柚皮苷含量在 24 h 內無明顯變化，具有良好的穩定性，可以滿足測定要求。試驗結果見表5。

表5 不同時間測定供試品中柚皮苷的峰面積

2.4.7 定量限考察

取“2.2”項下的對照品溶液，用80%甲醇逐級稀釋，制成低濃度的溶液，按“2.1”測定，直至待測成分的儀器信噪比(S/N)約為10∶1，取此時對照品溶液的濃度為定量限[6]。結果柚皮苷的定量限為 3.72 μg/mL。

2.5 樣品含量測定

取不同批號(批號220701、2208011、2209009)的坤寧顆粒，每批樣品分別按“2.3”平行制備2份供試品溶液，按“2.1”測定，計算，結果見表6。

表6 樣品含量測定結果(mg/g)

3 討論

3.1 指標成分的選擇

本實驗目的是建立監測坤寧顆粒中枳殼含量的方法，通過查閱文獻可知，枳殼中含有較多的黃酮類物質，包括橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、木犀草素等多種成分[7]，其中橙皮苷與柚皮苷作為枳殼的有效成分及活性物質，一定程度上反應了枳殼的質量優劣[8]，均可作為本研究的指標成分，前期實驗時發現樣品經甲醇提取后橙皮苷、木犀草素等含量較少，柚皮苷則較多，所以選擇柚皮苷作為坤寧顆粒中枳殼的指標成分進行測定。

3.2 色譜條件選擇

波長：預實驗中，采用PDA檢測器對柚皮苷對照品進行光譜掃描，通過光譜圖顯示的最大吸收，同時參考《中華人民共和國藥典》2020年版中枳殼以及其他含枳殼的中成藥含量測定的方法，將波長定為 283 nm。

流動相：預實驗中，選擇甲醇作為有機相，水、3%冰醋酸溶液作為水相，考察不同比例下樣品主峰的分離度，峰形與分離度均無法達到要求。后將有機相換成乙腈，水相換成不同濃度的磷酸溶液，峰形有了較大改善，等度時分離度依然無法達到要求。采用乙腈-磷酸系統梯度洗脫時，磷酸溶液濃度過高或者過低，均會導致色譜峰前拖嚴重。最終采用乙腈-0.1%磷酸溶液梯度洗脫的方式，此時峰形與分離效果均達到最佳狀態。

色譜儀：分別使用安捷倫1260、賽默飛3000進行進樣分析，結果不同儀器色譜峰分離度均不小于1.5，峰形良好，符合測定要求。

3.3 提取條件選擇

提取溶劑：預實驗中考察了使用乙醇、稀乙醇、甲醇、80%甲醇以及50%甲醇等溶劑的提取效果。使用乙醇與稀乙醇提取時，提取液 24 h 內不穩定，產生渾濁。使用甲醇提取時，不同濃度下柚皮苷提取量差別不大，80%甲醇提取量略多于其他，所以選擇80%甲醇作為最終的提取溶劑。

提取方法及時間：預實驗中考察了靜置過夜、振搖、加熱回流以及超聲提取等多種提取方法。靜置過夜與振搖同其他兩種方法相比提取效果較差，而加熱回流與超聲的提取效果相似，超聲提取簡單快捷，容易操作，所以選擇超聲提取。比較超聲提取 30 min、45 min 及 60 min，柚皮苷提取量相當，無明顯變化，所以選擇超聲提取 30 min。

3.4 方法評價

本方法中建立的HPLC法操作簡便，經方法學考察，重復性和分離度符合要求，準確度和穩定性良好，符合檢測需求，為進一步完善坤寧顆粒的質量標準提供了借鑒。