基于衍生化UPLC法測定不同產地天麻中19種游離氨基酸含量*

嚴春榮，魏建強，張海瑞，黃子玉，孫夢凡，劉祥義，侯 英**

(1.玉溪市質量技術監督綜合檢測中心，云南 玉溪 653100；2.云南華衡檢測技術有限公司，云南 昆明 650106；3.西南林業大學，云南 昆明 650224)

天麻(Gastrodia elata Blume)是名貴中藥材之一，隸屬蘭科天麻屬多年寄生草本植物，以干燥塊莖入藥，作為藥膳，具有息風止痙、平抑肝陽、祛風通路等藥理功效及保健、營養和食用價值[1]。現代藥理學研究表明，天麻具有腦保護、鎮痛、抗癲癇、抗暈眩、降壓、降血脂、保肝、增強免疫力等藥理活性[2-3]。游離氨基酸作為構成蛋白質分子的基本單位，是構成人體的最基本物質之一，具有調節人體氮平衡，增強免疫力和健體補虛的功效[4-5]。作為藥食同源的新食品原料，天麻中的游離氨基酸的含量能反映出天麻的營養價值。目前對天麻中游離氨基酸的相關研究報道相對較少，對其開展分析評價研究，可以為天麻的營養與質量評價及進一步開發利用天麻資源提供理論基礎。

采用氨基酸自動分析儀測定氨基酸含量已有報道[6-8]，但因儀器價格昂貴，所以采用柱前/柱后衍生結合液相色譜分析游離氨基酸含量，特別是柱前衍生化具有時間短、衍生物穩定、靈敏度高、重現性好等優勢受到研究者青睞[9]。殷嬌陽等[10]采用鄰苯二甲醛和9-氯甲酸芴甲酯聯用對靈芝孢子粉中的氨基酸進行柱前衍生，然后采用高效液相色譜法測定氨基酸的含量，結果準確、重復性好。楊衛靈等[11]以異硫氰酸苯酯為柱前衍生劑，結合液相色譜法，測定黔產瑪咖氨基酸的組成及含量，發現瑪咖中氨基酸種類齊全且含量豐富。

本文將天麻中游離氨基酸經6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯衍生化生成具有熒光的衍生物，經超高效液相色譜(UPLC)分離，用保留時間定性，標準曲線法定量，建立天麻游離氨基酸含量的測定方法，并對不同產區天麻中氨基酸含量進行對比分析，可為天麻的品質評價及種植基地選擇提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

U3000高效液相色譜儀(配熒光檢測器，美國熱電公司)；BSA224S電子天平(感量：0.1 mg，賽多利斯公司)；RD-C18色譜柱(Ф4.6 mm×250 mm，3 μm，中譜紅)；KQ-500DE型超聲波萃取儀(昆山市超聲儀器有限公司)。Ф13 mm×0.45 μm 微濾膜過濾器(天津騰達過濾器件廠)；Milli-Q 純水儀(美國Millipore公司)；HMS-350渦旋振蕩器(天津市恒美科技發展有限公司)；電熱恒溫干燥箱(旭朗機械設備有限公司)。

乙腈(色譜純，德國Merck公司)；衍生化試劑：6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯(CAS：148757-94-2，w≥97%，上海源純生物科技公司)。

19種標準品：γ-氨基丁酸(CAS：56-12-2)、L-丙氨酸(CAS：56-41-7)、L-苯丙氨酸(CAS：63-91-2)、L-蛋氨酸(CAS63-68-3)、L-脯氨酸(CAS：147-85-3)、甘氨酸(CAS：46-40-6)、L-胱氨酸(CAS：56-89-3)、L-谷氨酸(CAS：56-86-0)、L-谷氨酰胺(CAS：56-85-9)、L-精氨酸(CAS：74-79-3)、L-賴氨酸(CAS：56-87-1)、L-酪氨酸(CAS：60-18-4)、L-亮氨酸(CAS：61-90-5)、L-蘇氨酸(CAS：72-19-5)、L-絲氨酸(CAS：56-45-1)、L-天冬氨酸(CAS：56-84-8)、L-天冬酰酸(CAS：70-47-3)、L-纈氨酸(CAS：72-18-4)、L-異亮氨酸(CAS：73-32-5)、L-組氨酸(CAS：71-00-1) (質量分數均大于98%，購自上海源純生物科技公司)。

9個批次天麻樣品采自云南、四川、貴州和陜西等地。其中，云南昭通(A1-A3)、云南其他州市(B4-B6)、省外(C7-C9)。樣品采集后用自來水洗凈塊莖部位，再用蒸餾水沖洗3次，隔水蒸透心，60 ℃ 烘箱干燥。粉碎后過60目篩，存放于自封袋中備用。

1.2 溶液的配制

1.2.1 流動相A的配制

準確稱取 190.4 g 無水乙酸鈉置于燒杯中，加入適量水，超聲溶解后，加入 100 mL 質量濃度為 1 mg/mL EDTA(100 mg 溶解至 100 mL 水中)溶液，加入三乙胺 24.0 mL，轉入容量瓶中加水定容至 1000 mL，搖勻。用磷酸調節pH至4.95，加入 0.1 g NaN3過濾，使用時量取 100 mL 定溶至 1000 mL，搖勻備用。

1.2.2 衍生化溶液的配制

稱取 0.3 g 6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯于 100 mL 乙腈中，渦旋振蕩 30 s，55 ℃ 加熱 5 min 至6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯全部溶解，配制成 3 mg/mL 的衍生化試劑。

1.2.3 游離氨基酸標準儲備液的配制

分別精密稱取γ-氨基丁酸 13.16 mg、L-丙氨酸 11.31 mg、L-苯丙氨酸 20.60 mg、L-蛋氨酸 18.89 mg、L-脯氨酸 15.65 mg、甘氨酸 10.4 1mg、L-谷氨酸 18.92 mg、L-谷氨酰胺 18.24 mg、L-精氨酸 21.37 mg、L-賴氨酸 18.87 mg、L-酪氨酸 22.54 mg、L-亮氨酸 16.81 mg、L-蘇氨酸 15.17 mg、L-絲氨酸 13.62 mg、L-天冬氨酸 16.84 mg、L-天冬酰胺 16.68 mg、L-纈氨酸 15.03 mg、L-異亮氨酸 14.58 mg、L-組氨酸 20.52 mg 各于 10 mL 容量瓶中，加入適量的 0.1 mol/L 鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻即為標準儲備液。

1.2.4 標準工作溶液的配制

分別精密移取 1 mL 的19種游離氨基酸儲備液于 25 mL 容量瓶中，加入適量的 0.1 mol/L 鹽酸溶液并稀釋至刻度，搖勻即得標準工作溶液1；精密移取 8 mL 標準工作溶液1于 10 mL 容量瓶中，加入適量的 0.1 mol/L 鹽酸溶液并稀釋至刻度，搖勻即得標準工作溶液2；精密移取 5 mL 標準工作溶液2；10 mL 容量瓶中，加入適量的 0.1 mol/L 鹽酸溶液并稀釋至刻度，搖勻即得標準工作溶液3；精密移取 5 mL 標準工作溶液3，于 10 mL 容量瓶中，加入適量的 0.1 mol/L 鹽酸溶液并稀釋至刻度，搖勻即得標準工作溶液4；精密移取 5 mL標準工作溶液4，于 10 mL 容量瓶中，加入適量的 0.1 mol/L 鹽酸溶液并稀釋至刻度，搖勻即得標準工作溶液5；精密移取 5 mL 標準工作溶液5，于 10 mL 容量瓶中，加入適量的 0.1 mol/L 鹽酸溶液并稀釋至刻度，搖勻即得標準工作溶液6。

1.3 色譜條件

熒光檢測器激發波長 250 nm，發射波長 395 nm，PMT增益值為1；柱溫 40 ℃。流動相流速為 1 mL/min；進樣量為 2 μL；梯度洗脫條件見表1所示。

表1 梯度洗脫程序

1.4 樣品測定方法

稱取 0.2 g 制備好的樣品于 10 mL 具塞離心管中，加入 10 mL 的 0.1 moL/L 的鹽酸溶液，超聲萃取 30 min，取上層清液過 0.45 μm 濾膜，備用。

移取衍生用緩沖液 70 μL 于潔凈的玻璃內插管中，移取樣品萃取液或標準工作液 10 μL 迅速渦旋混勻，然后加入衍生化試劑 20 μL，渦旋混勻 10 s，加蓋密封于進樣瓶中，室溫靜置 1 min，轉移至 55 ℃ 烘箱中，加熱 10 min，取出進行HPLC測定。用色譜工作站記錄峰面積，采用外標法計算游離氨基酸的含量。每份樣品重復檢測2次，取平均值為該樣品中游離氨基酸的含量。天麻樣品中19種游離氨基酸的色譜圖見圖1，色譜峰分離良好。

圖1 天麻樣品中19種游離氨基酸測定的色譜圖

2 結果與分析

2.1 標準曲線制作

配制一系列不同質量濃度的游離氨基酸混合標準溶液，按1.3色譜條件進樣測定。以峰面積(Y)對質量濃度(X，μg/mL)進行線性回歸，計算回歸方程和相關系數(見表2)，各組分標準曲線的相關系數在0.9969～0.9997范圍，表明19種游離氨基酸在一定質量濃度范圍內線性關系良好。通過測定各游離氨基酸信噪比為3∶1時所對應的質量濃度，計算各游離氨基酸的檢出限在1.41～75.42 μg/kg 范圍。

表2 天麻中游離氨基酸的回歸方程、相關系數和檢出限

2.2 重現性考察

稱取6份混合標準品，按“1.4樣品測定方法”進行測定，計算6次測定的相對標準偏差(RSD)在0.32 %～1.67 %之間，能夠滿足樣品分析的精密度要求。

2.3 加標回收率

稱取相同的樣品6份，其中3份中分別加入一定質量濃度的游離氨基酸混合標準溶液，3份作為對照，按“1.4樣品測定方法”進行測定。根據測定結果計算加標回收率在91.99 %～114.59%之間，表明用該方法測定天麻中游離氨基酸具有較高的回收率，適用于天麻中游離氨基酸的定量測定。

2.4 不同產區天麻樣品游離氨基酸含量分析

不同產區的天麻樣品中游離氨基酸的測定結果見表3。從來自不同產區的天麻樣品中檢測出7種人體必需游離氨基酸(纈氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、蘇氨酸和蛋氨酸)，10種人體非必需游離氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸、組氨酸、酪氨酸)及2種其它游離氨基酸(天冬酰胺和γ-氨基丁酸)。結果表明，天麻中游離氨基酸種類及含量豐富，與其具有滋補功效相符。從測定數據看出，不同產地天麻中的游離氨基酸含量存在一定差異，天麻中19種游離氨基酸總量的平均值為 404.46 mg/100 g，總量范圍在362.12～644.95 mg/100 g 之間。19種游離氨基酸中含量較高的是谷氨酰胺、天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等，含量較低的是蛋氨酸、氨基丁酸、組氨酸、亮氨酸和脯氨酸等。

表3 不同地區天麻樣品游離氨基酸平均含量測定結果 (n=2，mg/100 g)

從表3看出，天麻中19種游離氨基酸總量平均值是云南昭通天麻(517.41 mg/100 g)>省外天麻(507.68 mg/100 g)>云南省內其他地州(444.56 mg/100 g)。云南昭通天麻中的天冬酰胺、天冬氨酸和精氨酸的含量高于其他產區；而省外天麻中的谷氨酸、酪氨酸、纈氨酸、賴氨酸、異亮氨酸、亮氨酸等含量高于云南省各產區，特別是在一個省外天麻樣品中測定出蛋氨酸，而其他產區的天麻樣品中未檢出。

3 結論

本文通過6-氨基喹啉-N-羥基琥珀酰亞胺氨基甲酸酯為衍生化試劑，結合HPLC法建立天麻中19種游離氨基酸的測定方法。該方法具有精密度好、重現性高等優點，適宜于天麻中多種游離氨基酸的含量測定。測定結果表明，天麻中游離氨基酸種類及含量豐富，不同產地的天麻中游離氨基酸含量存在一定差異。天麻作為我國重要的藥食同源藥材，游離氨基酸為其滋補作用的主要成分之一，對其研究有助于為天麻的品質評價及種植基地選擇提供科學依據。