不同廠家二丁顆粒微生物限度檢查方法建立及結果分析評價

李昀錚

松原市食品藥品檢驗所，吉林 松原 138000

二丁顆粒具有清熱解毒、利濕退黃的功效，臨床上多用于熱癤癰毒、咽喉腫痛、風熱火眼等相關疾病的治療[1-2]。其主要藥材如紫花地丁、蒲公英以及板藍根等都具有一定的抑菌效果，因此在對其進行微生物限度檢查時，原則上必須遵照《中國藥典》要求的方法，先開展供試液抑菌活性的消除工作，之后再推進下一步的檢查。

本研究通過對5 個相關生產企業中的15 批次二丁顆粒進行檢測，利用方法學驗證來找出合適的微生物限度檢驗方式，進而對選中的5 個生產企業中15 批次的二丁顆粒進行微生物限度檢驗，然后對檢驗結果進行分析和探討，以期為眾多二丁顆粒生產企業提供一定的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BSC-1304IIA2 蘇凈安泰生物安全柜、BHC-1300IIA2 蘇州安泰生物安全柜、BXP-280S 智能微生物培養箱（上海博訊實業有限公司），SPX-150 生化培養箱(揚州慧科電子有限公司)，BPX-272 型電熱恒溫培養箱（上海博訊實業有限公司），BAXSystem Q7 全自動病原微生物快速檢測系統（美國-杜邦），SHZ-82A 水浴恒溫振蕩器（金壇市白塔金昌實驗儀器廠），移液器（德國VITLAB），YXQ-LS-100SII 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司），BXM-30R 立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊實業有限公司）。

1.2 樣品

本次實驗所用到的二丁顆粒是5 家公司共15個批次的產品，見表1。

表1 二丁顆粒生產廠家及批次

1.2.1 培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA，批號：220426）；胰酪大豆胨液體培養基（9S-CD，批號：220519）；沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA，批號：220616）；麥康凱液體培養基（批號：220426）；麥康凱瓊脂培養基（批號：220505）。上述培養基均已通過培養基適用性檢查。

1.2.2 稀釋液

pH 為7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液(批號：220118)，0.05%（V/V）聚山梨酯80 稀釋液，pH 為7.0的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液和稀釋液均購于北京路橋技術股份有限公司。0.9%氯化鈉，購于天津市科密歐化學試劑有限公司（批號：20200916）。

1.2.3 菌種（傳代次數，來源）

金黃色葡萄球菌ATCC6538：第1 代；銅綠假芽孢桿菌ATCC9027：第1 代；枯草芽孢桿菌ATCC6633：第1 代；白色念珠菌ATCC10234：第1 代；黑曲霉菌ATCC16404：第1 代；大腸埃希菌ATCC25922：第1代。來源：美國菌種保藏中心。

2 方法與結果

2.1 菌液的制備

遵照《中國藥典》2020 版四部通則1108 的規定進行配制[3]。

2.2 供試液的制備

取供試品10 g，加入100 mL pH 為7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，置于40 ℃恒溫水浴并振蕩直至其完全溶解，即得到1∶10 的供試液A。利用逐級稀釋法，再得到1∶100 的稀釋液樣品b 和1∶1 000 的稀釋液樣品c。

2.3 需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數計數方法適用性試驗

陽性菌組：從“2.1”選項中提前準備好的稀釋級菌液中，取出0.1 mL 制備好的菌液（菌量不大于10 000 CFU/mL），將其加入9.9 mL pH 為7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液中，根據規定量和方法注入平皿和規定的培養基中，將按照規定時間和溫度進行培養后測得的菌數記作a；試驗組對照組：取5 份10 mL 供試液A 分別和5 種含有0.1 mL 試驗菌的菌液置于無菌管中，混勻，并按照上述方法測得菌數b；供試液對照組：取10 mL 供試液A 和0.1 mL pH為7.0 的無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液置于無菌管中，按上述方法測得菌數c；計數結果按照如下公式進行計算：回收率：R=（b-c）/a×100%，當R 值在0.5～2范圍內對，可認為此法能夠用于該樣本細菌數量的統計[4-5]。

基于二丁顆粒的抑菌作用，采用供試液按照1:10 培養基稀釋法（5 倍稀釋法即在5 個平皿中，每個皿中都含有供試液0.2 mL，各加入15～20 mL 胰酪大豆胨瓊脂培養基）作為需氧菌總數進行計算，按照規定量和方法注入平皿與規定的培養基中，并按規定時間和溫度進行培養后測得回收率的結果。實驗表明，以上5 種菌株的回收率范圍均在0.5～2 之間。

2.4 大腸埃希菌檢驗方法適應性檢驗

試驗組：將10 mL 供試液A 接種到100 mL 胰酪大豆胨液體培養基中，并將其與大腸桿菌的菌懸液（不大于100 CFU）混合。陽性對照組：將1 mL 大腸埃希菌菌懸液加入100 mL 胰酪大豆胨液體培養基中。供試液對照組：用供試品代替試驗組液體進行試驗。陰性對照組：同批滅菌配制、完成滅菌的胰酪大豆胨液體培養基。以上試驗組、陽性對照組、供試液組及陰性對照組均按《中國藥典》2020年版的四部要求進行試驗。

測試結果顯示，在15 批次的檢驗樣本中，在測試的對照和陽性對照樣本中，大腸埃希菌都是在測試樣本（加菌）生長的，供試組（未加菌）以及陰性對照組中均沒有生長表現。由此可以得出，此方法適用于本品的控制菌檢查。

2.5 此次微生物限度檢驗結果

根據此次的檢驗結果，本次試驗二丁顆粒的微生物限度標準如下：需氧菌總數不可以超過103CFU/g；霉菌和酵母菌法的總數不可以超過102CFU/g；不可以檢出大腸埃希菌。

此次微生物限度檢驗結果如下：此次試驗中15批次的二丁顆粒需氧菌總數，霉菌和酵母菌總數合格率為100%，都沒有檢出大腸埃希菌。

3 分析

二丁顆粒中的紫花地丁、蒲公英、板藍根等藥材均具有抑菌性。其中紫花地丁提取物的抑菌活性按照大小順序依次為：停乳鏈球菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞無乳鏈球菌＞乳房鏈球菌＞沙門氏菌[6]。其中蒲公英的多項成分如總黃酮、多糖綠原酸分別對大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌、枯草芽草桿菌等有抑制作用[7]；板藍根能有效抑制金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌，具有光譜抗菌作用[8]。通過試驗發現不同藥廠經過工藝提取后的二丁顆粒對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和銅綠假單胞菌的抗菌效果各不相同，這可能是因為每個廠家的工藝不同，受工藝影響，其抑菌強度也會有所變化。相信隨著技術水平的提高與工藝的完善，中藥口服制劑受到的污染因素會有所減少，使微生物限度檢查指標提升，藥品質量控制進一步發揮作用。

4 結論

本文通過對15 批次二丁顆粒微生物限度的方法學檢驗，得出如下結果：需氧細菌總數的測定可以使用培養基稀釋法，霉菌、酵母菌、大腸埃希菌的測定可以使用常規法。最終研究結果表明，來自5 個生產企業的15 個批次二丁顆粒的微生物限度檢查結果都符合規定。