基于骨髓間充質干細胞分離培養的原代細胞培養技術在細胞生物學實驗課程中的應用和思考

呂歡歡，劉悅彤，王建萍，呂 毅

西北工業大學生命學院，陜西 西安 710072

細胞生物學既是生命科學的基礎學科，也是其前沿學科；對細胞的研究既是生命科學的出發點，又是生命科學的匯聚點[1]。細胞是生命活動的基本結構和功能單位。通過細胞培養可以獲得大量細胞，并且生物學、藥學、醫學等諸多領域也都涉及細胞的研究，所以都離不開細胞培養技術的應用，這也進一步凸顯了細胞培養技術在生物技術專業本科生實驗技能培養過程中的重要性[2]。

細胞培養是開展細胞生物學研究的基礎，也是生物學最基本的實驗操作技術之一[3]。細胞培養可分為原代細胞培養和繼代細胞培養。本文所研究的原代細胞培養是指直接從生物體內獲取組織或者器官的一部分細胞進行培養，是獲取細胞的主要手段，是建立各種細胞體系的第一步，也是從事組織或細胞培養相關研究工作必須掌握的一項基本技術[4]。

間充質干細胞是中胚層來源的成體干細胞，具有多向分化和自我更新能力[5-8]。骨髓中間充質干細胞的含量最為豐富，是最先被分離出來的成體干細胞。骨髓中的間充質干細胞在不同條件下可以誘導分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等，因此被廣泛應用于骨相關疾病的治療[9-10]。掌握骨髓間充質干細胞的分離和培養方法，了解骨髓間充質干細胞的定向誘導分化，有助于為后期利用骨組織工程技術治療臨床疾病提供理論依據。

1 教學設計

1.1 實驗原理

原代細胞培養是指直接從動物體內獲取所需組織（或器官）的一部分細胞，經分離或消化分散成單個游離細胞，在體外通過人工培養使其不斷生長繁殖，直到第一次傳代為止。但原代培養的組織由多種成分組成，比較復雜，一般需要對原代培養細胞進行傳代，然后再開展后續實驗。骨髓間充質干細胞的分離方法包括密度梯度離心法、全骨髓貼壁法、骨片消化爬片法等[11-13]。本實驗將運用全骨髓法，根據干細胞在低血清培養基中具有貼壁優勢的特性，從小鼠股骨和脛骨中獲得全骨髓，通過多次換液得到較純的骨髓間充質干細胞。

1.2 實驗材料與設備

實驗動物：8 周齡C57BL/6J 小鼠。

實驗試劑：DMEM 高糖完全培養基（含10%胎牛血清和1%霉素/鏈霉素混合液），75%酒精。

實驗耗材和設備：倒置顯微鏡、離心機、水浴鍋、CO2培養箱、超凈工作臺、無菌眼科剪刀、眼科鑷子、離心管、紗布、注射器、9 cm 細胞培養皿和6 cm 細胞培養皿。

1.3 實驗步驟

1.3.1 實驗小鼠骨頭的取材

將小鼠用異氟烷麻醉后，予以頸椎脫臼處死，然后用75%酒精浸泡消毒10 min。將無菌的眼科剪刀、鑷子、紗布、離心管、注射器、培養皿等器材放入超凈工作臺中。在超凈工作臺中，將小鼠平放在9 cm 細胞培養皿中，腹部朝上，取出小鼠雙側長骨包括股骨和脛骨，并剝離附著在長骨上的毛發和皮膚等（見圖1）。

圖1 實驗小鼠骨頭的取材

1.3.2 制備骨髓收集管

準備1.5 mL 和0.5 mL 的無菌離心管。將0.1 mL 預熱的DMEM 完全培養基置于1.5 mL 離心管中，用注射器針頭在0.5 mL 離心管底部扎幾個小孔。將打孔的0.5 mL 離心管放入1.5 mL 離心管中（見圖2）。

圖2 制備骨髓收集管

1.3.3 股骨和脛骨的清理

去除掉附著在長骨上的肌肉組織，用紗布將殘留在長骨上的肌肉擦拭干凈，剪斷長骨，分離股骨和脛骨，并從骨頭中間剪斷，將斷口朝下放在0.5 mL離心管中，將1.5 mL 離心管管蓋剪斷，蓋上0.5 mL離心管的蓋子，用封口膜密封離心管（見圖3）。

圖3 股骨和脛骨的清理

1.3.4 離心收集骨髓

在4 000 r/min 的轉速下離心5 min，離心完成后取出0.5 mL 離心管，可以看到股骨和脛骨已經泛白，表明股骨和脛骨中的骨髓已經離心到了1.5 mL離心管中。取出1.5 mL 離心管中的樣品加入含有完全培養基的新的1.5 mL 離心管中。再將該新的1.5 mL 離心管在1 000 r/min 的條件下離心10 min。離心過程中，準備好培養皿，并做好標記（見圖4）。

1.3.5 培養細胞

向細胞培養皿中加入DMEM 完全培養基。棄去第二次離心后離心管中的上清液，得到培養基重懸細胞沉淀。將細胞懸液轉移至細胞培養皿中，輕輕搖勻，使細胞在培養皿中均勻分布（見圖5）。在37℃、5% CO2培養箱中靜置培養，培養期間不得晃動培養皿，以使細胞充分貼壁。

圖5 細胞培養

1.3.6 實驗結果觀察

培養48 h 后，棄去原培養基，加入新鮮的DMEM 完全培養基，之后每隔48 h 換液1 次（見圖6A）。培養至70%～80%融合時（約6～7 d），即可進行細胞傳代培養（見圖6B）。

圖6 小鼠骨髓間充質干細胞分離培養在不同時間點的形態圖

2 利用小鼠骨髓間充質干細胞可開展的實驗

2.1 利用小鼠骨髓間充質肝細胞進行成脂分化

小鼠骨髓間充質干細胞傳代后，當細胞融合到80%以上時，棄去原培養基，向其中添加成脂誘導培養基。成脂誘導培養基為向DMEM 基礎培養基中添加10%胎牛血清、1%雙抗、10 ng/mL 胰島素、1 μM地塞米松、0.5 mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和0.1 mM 吲哚美辛所得。每隔48 h 換液1 次，分化10 d后，在顯微鏡下可以看到較為明顯的脂滴，用油紅O染液對其進行染色。

2.2 利用小鼠骨髓間充質肝細胞進行成骨分化實驗

小鼠骨髓間充質干細胞傳代后，在細胞融合到80%以上時，棄去原培養基，向其中添加成骨誘導培養基。成骨誘導培養基為向DMEM 基礎培養基中添加10%胎牛血清、1%雙抗、50 μg/mL 維生素和10 mM β-甘油磷酸鈉所得。每隔48 h 換液1 次，分化10 d 后，在顯微鏡下可以看到較為明顯的礦化結節，用5%的茜素紅染液對其進行染色。

2.3 利用小鼠骨髓間充質肝細胞進行成軟骨分化實驗

小鼠骨髓間充質干細胞傳代后，在細胞融合到80%以上時，棄去原培養基，向其中添加成軟骨誘導培養基。成軟骨誘導培養基為向DMEM 基礎培養基中添加10%胎牛血清、1%雙抗、0.2 mM 維生素和10 mM β-甘油磷酸鈉所得。每3 d 換液1 次，分化10 d，用甲苯胺藍染液對其進行染色。

3 教學設計

3.1 教學目的

了解原代細胞培養原理；熟悉原代細胞的培養方法與過程；掌握骨髓間充質干細胞的分離與培養方式；掌握無菌操作；了解骨髓間充質干細胞的應用情況。

3.2 教學重點

在本次實驗教學過程中，采用離心法從股骨和脛骨中獲得骨髓間充質干細胞；同時，也可以采用使用針管沖洗股骨和脛骨骨髓以獲得骨髓間充質干細胞的方法。無論采用哪一種方法，都要注意不能破壞細胞的完整性。獲得細胞后，基于先前在實驗課學得的細胞培養技術，對骨髓間充質干細胞進行繼代培養，從而使同學進一步掌握并鞏固細胞培養技術。細胞培養工作最關鍵的環節就是注意無菌操作，防止細胞在培養過程中受到污染。原代細胞培養要從器官或者組織中直接獲取細胞，因此，材料的消毒要非常嚴格；而且，在整個取材過程和骨髓間充質干細胞的分離過程中都要注意無菌操作。

3.3 教學安排

開課前，授課教師準備實驗耗材試劑和實驗小鼠。

本實驗共安排4 課時，學生在實驗課堂上需要完成實驗小鼠股骨和脛骨的取材、骨髓收集管的制備、骨頭附屬物的剝離、離心收集骨髓、培養細胞等步驟。實驗課結束之后，學生可自行觀察細胞的生長情況。

另外，學生可根據自己的興趣偏好，利用培養得到的骨髓間充質干細胞進行細胞傳代、凍存等細胞培養基本實驗技術的練習，以鞏固細胞培養操作；或者利用培養的骨髓間充質干細胞進行成骨、成脂、成軟骨分化實驗；還可以設計并開展化學或者物理刺激對骨髓間充質干細胞分化影響的研究等綜合實驗。

3.4 教學意義

細胞生物學是生命科學相關專業的實踐類專業基礎課，是一門研究和解釋細胞基本生命活動規律的學科。本實驗在進行細胞培養的基礎上進行，通過骨髓間充質干細胞的分離和培養，不僅能夠使同學們掌握原代細胞培養的基本原理和方法，也能夠讓學生更加深刻地認識到骨髓間充質干細胞的多潛能性分化。并且，在達到原代細胞培養基本實驗教學目的的基礎上，將科研內容引入實驗教學中，鼓勵學生開展以“骨髓間充質干細胞分化研究”為主題的設計性實驗，還能夠激發學生的多元實驗設計思維和開展綜合性創新實驗的動力。