蒺藜生藥粉及其水提取物的肝毒性作用機制研究

羅福祥 馬福昌 艾西木江·熱甫卡提 阿不都吉力力·阿布都艾尼 竇 勤 尤力都孜·買買提 高 莉 庫爾班尼沙·麥提卡思木

(1 新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所毒理學研究室,烏魯木齊,830011; 2 新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所,新疆維吾爾自治區維吾爾醫方劑學重點實驗室,烏魯木齊,830011)

蒺藜為蒺藜科植物蒺藜(TribulusterrestrisL.)的干燥成熟果實。中醫認為其辛、苦,微溫,有小毒,歸肝經,用于平肝解郁,活血祛風,頭痛眩暈,胸脅脹痛,乳閉乳癰,目赤翳障,風疹瘙癢[1]。蒺藜含有皂苷類、黃酮類等化合物[2],現代臨床應用和毒理學研究發現蒺藜對肝臟具有一定的毒性作用[3-6],國家食品藥品監督管理局藥品評價中心早在2005年藥品不良反應信息通報(第9期)發布了蒺藜復方白蝕丸不良反應的信息通報[7],因此,臨床應用中需重點監測肝腎功能相關指標。目前,其肝毒性特點及作用機制均未見報道,本研究通過組織病理學、實時PCR、酶聯免疫吸附試驗法,從肝組織病理學、氧化應激、肝細胞極性改變相關及膽汁合成、轉運、攝取、代謝相關基因蛋白表達變化等方面,探討蒺藜的肝毒性作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 斯潑累格·多雷(Sprague-Dawley,SD)大鼠140只,鼠齡為4～6周,體質量130～150 g,雌雄各半,購自新疆醫科大學,實驗動物許可證號:SCXK(新)2018-0002,飼養條件為SPF(無特定病原體)屏障環境,室溫為20～26 ℃,相對濕度為40%～70%,光照黑暗各12 h,動物使用許可證:SYXK(新)2021-0004。經新疆維吾爾醫藥研究所動物實驗倫理委員會審批(倫理審批號:nGLP2020-007),根據中國國家動物保護局衛生和醫學研究委員會動物條例用于科學目的的護理和使用。

1.1.2 藥物 蒺藜生藥粉,黃綠色粉末,由南通飛宇生物科技有限公司提供,批號:FY200619。蒺藜水提物,棕褐色粉末,由南通飛宇生物科技有限公司提供,批號:FY200616。提取方法:取一定量的蒺藜,粉碎,分別加10倍量的水回流提取3次,1 h/次,合并提取液,干燥得干浸膏,稱重,計算浸膏得率為5%。

1.1.3 試劑與儀器 全自動生化分析儀(日立公司,日本,型號:7100型),脫水機(浙江金華科迪儀器設備有限公司,型號:KDTS3D),包埋機(浙江金華科迪儀器設備有限公司,型號:KD-BMII),切片機(LEICA,德國,型號:RM2235),PCR儀(Bio-Rad,美國,型號:MyCycler Thermal),酶標儀(Bio-Rad,美國,型號:xMarkTM)。超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)試劑盒(江萊生物,批號:JL22893),谷胱甘肽(Glutathione,GSH)試劑盒(江萊生物,批號:JL21016),丙二醛(Malondialdehyde,MDA)試劑盒(江萊生物,批號:JL13297),BCA蛋白濃度測定試劑盒(北京索拉比奧科技有限公司,貨號:PC0020),PCR引物:法尼酯X受體(Farnesoid X Receptor,FXR)(Bioss Inc.,批號:bs-22519R),過氧化物酶體增殖物激活受體α(Peroxisome Proliferator-activated Receptor,PPAR α)(Bioss Inc.,批號:bs-3614R),β-actin(Bioss Inc.,批號:bs-0061R),細胞色素7A1(Cytochrome P450 7A1,CYP7A1)[生工生物工程(上海)股份有限公司,批號:D161909]。

1.2 方法

1.2.1 劑量設置 蒺藜生藥粉(JLF):臨床擬服用量為6～10 g,按照成人體質量60 kg計算,臨床擬用量為0.17 g生藥/kg。其大鼠的等效劑量為1.071 g生藥/kg,按照相關技術指導原則要求,長期毒性試驗低劑量應高于動物等效劑量。因此試驗選取2.125 g生藥/kg作為JLF低劑量,以4.250 g生藥/kg為JLF中劑量,8.500 g生藥/kg為JLF高劑量,分別為臨床用量的12.5、25、50倍。3個劑量呈1∶2∶4倍數關系,濃度分別為0.07、0.14、0.28 g供試品/mL,以期獲得毒性的劑量-反應關系。蒺藜水提物(JLS):其提取率為5%,按照成人體質量60 kg計算,臨床擬用量為0.17 g生藥/kg,相當于0.008 5 g水提物/kg。按照相關技術指導原則要求,長期毒性試驗低劑量應高于動物等效劑量。因此試驗選取0.43 g水提物/kg作為JLS低劑量,以0.85 g水提物/kg為JLS中劑量,1.70 g水提物/kg為JLS高劑量,分別為臨床用量的50、100、200倍。3個劑量呈1∶2∶4倍數關系,濃度分別為0.04、0.09、0.17 g供試品/mL,以期獲得毒性的劑量-反應關系。

1.2.2 分組與給藥 選取健康SD大鼠140只,雌雄各半,按隨機數字表法隨機分為正常對照組,蒺藜粉低、中、高劑量組,蒺藜水提物低、中、高劑量組。將蒺藜生藥粉及蒺藜水提物分別用動物飲用水配制成相應給藥濃度,10 mL/kg,灌胃給予SD大鼠。蒺藜生藥粉低、中、高劑量組2次/d,蒺藜水提取物低、中、高劑量組1次/d,連續灌胃給予大鼠1個月,每日觀察動物有無中毒情況發生。給藥末次當晚,動物禁食不禁水,次日稱取禁食體質量,1%戊巴比妥鈉4 mL/kg腹腔注射進行麻醉解剖,腹主動脈采血進行血液學檢測,取部分新鮮肝臟置于液氮中分裝保存,部分肝臟組織置于10%的中性甲醛中制作病理切片,進行組織病理學觀察。

1.2.3 血液生化檢測 采用一次性真空采血管腹主動脈采血,內含分離膠+促凝劑(血清管),腹主動脈取血,立即輕輕混勻。采血后靜置30 min,3 000 r/min,離心10 min,離心半徑14 cm,分離血清,全自動血液生化分析儀檢測大鼠血清中谷草轉氨酶(Glutamic-oxaloacetic Transaminase,GOT)、谷丙轉氨酶(Glutamic-pyruvic Transaminase,GPT)、堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,ALP)、總膽紅素(Total Bilirubin,TBIL)的含量。

1.2.4 肝組織能量代謝相關指標檢測 按照CBA蛋白濃度測定試劑盒說明書對各組大鼠肝臟組織樣本進行蛋白進行定量,酶聯免疫吸附試驗法檢測大鼠肝臟中相關代謝指標。具體按試劑盒操作,在反應終止后用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的吸光度值(A值)。按照公式計算得到吸光度比值,通過ELISACalc軟件以吸光度比值為Y軸,以標準品濃度為X軸擬合標準曲線,進行計算得到樣本含量。

1.2.5 PCR檢測肝組織中FXR、CYP7A1、PPAR α的表達 肝臟組織樣本用液氮充分研磨,取50 mg于離心管中,加1 mL Trizol充分混勻,室溫靜置10 min至組織完全裂解。加200 μL氯仿混勻放置5 min。4 ℃,12 000 r/min,離心15 min,離心半徑8.5 cm。取上清于另一新離心管中,加入等體積異丙醇混勻,-20 ℃靜置30 min。4 ℃,于12 000 r/min,離心15 min,離心半徑8.5 cm,棄上清液。加入75%乙醇,使沉淀漂浮起來洗滌。4 ℃,12 000 r/min,離心15 min,離心半徑8.5 cm,棄上清,重復步驟1次。空管離心,吸盡液體,晾干。用RNase free水溶解沉淀。核酸蛋白定量儀檢測RNA純度,瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。剩余RNA置于-80 ℃保存或直接反轉錄成第一鏈cDNA,用于后續實驗。第一鏈cDNA合成混勻后25 ℃反應10 min,42 ℃反應30 min,85 ℃反應5 s取出,結束反轉錄實驗。將反轉錄得到的cDNA置于-80 ℃保存,用于后續實驗。熒光定量引物信息見表1。

表1 熒光定量引物信息

2 結果

2.1 一般觀察 未發現大鼠一般形態外觀、狀況活動、飲食情況、分泌物、排泄物等異常。給藥結束解剖大鼠觀察,結果蒺藜生藥粉、蒺藜水提取物均可引起大鼠肝臟顏色變深,但與正常對照組比較,給藥各組肝重量、肝系數均無明顯變化。見表2。

表2 蒺藜對SD大鼠肝臟系數的影響

2.2 血液生化學檢測結果 與正常對照組比較,給藥各組TBIL、ALP無顯著變化,差異無統計學意義(P>0.05);JLF高劑量組GOT顯著升高,差異有統計學意義(P<0.01),JLS高劑量組GOT、GPT顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05,P<0.01)。見表3。

2.3 肝組織能量代謝相關指標檢測結果 與正常對照組比較,蒺藜生藥粉各劑量組大鼠肝組織中GSH、MDA、SOD蛋白表達均差異無統計學意義;蒺藜水提取物高劑量組GSH表達顯著升高(P<0.05),中、高劑量組MDA蛋白表達顯著升高(P<0.01),低劑量組SOD顯著降低(P<0.05)。見表4。

2.4 FXR、CYP7A1、PPAR α蛋白表達結果 與正常對照組比較,蒺藜生藥粉各劑量組大鼠肝組織中FXR、PPAR α蛋白表達,差異無統計學意義(P>0.05),蒺藜生藥粉中、高劑量組CYP7A1表達顯著升高,差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。與正常對照組比較,蒺藜水提物各劑量組大鼠肝組織中FXR蛋白表達,差異無統計學意義(P>0.05),蒺藜中劑量組CYP7A1表達顯著升高(P<0.01),蒺藜高劑量組PPARα顯著降低(P<0.01)。見表5。

表3 蒺藜生藥粉及水提取物對SD大鼠血生化指標的影響

表4 蒺藜生藥粉及水提取物對SD大鼠肝組織能量代謝相關指標的影響

2.5 組織病理學結果 蒺藜生藥粉、蒺藜水提取物分別以相應濃度經口給予SD大鼠1個月,結果蒺藜生藥粉、蒺藜水提取物均可引起大鼠肝臟顏色變深。組織病理學檢查JLF中、高劑量組及JLS各劑量組均可見肝細胞水腫、肝細胞脂肪變性,灶狀炎癥細胞浸潤,且蒺藜水提取物程度更深。組織病理學結果顯示,蒺藜可能對肝臟具有一定的毒性作用。見圖1。

表5 蒺藜生藥粉及水提取物對SD大鼠肝組織FXR、 CYP7A1、PPAR α表達的影響

圖1 蒺藜生藥粉及水提物對SD大鼠肝臟組織形態學影響(HE染色,×100)

3 討論

中藥藥源性肝損傷是藥物及其代謝物直接損害肝臟所致,可細分為肝細胞型、膽汁淤積型和混合型肝損傷[8-9]。中藥肝毒性的評價多以肝細胞直接毒性為考察指標[10],當肝臟受到一定損傷時,會導致肝細胞變性、壞死,使細胞內容物溢出進入血液,而血清或者血漿中GOT、GPT等相關酶含量或活性變化是臨床評價肝細胞受損程度的重要指標[11-13]。NO是一種活性很強的自由基[14],在體內的最終氧化產物為MDA,而MDA具有潛在的細胞毒性,可攻擊神經元細胞功能蛋白,改變其活性,進而影響細胞的正常功能,其含量高低反映了組織過氧化損傷的程度[15-16]。CYP7A1是CYP450酶系中重要的亞型,在肝臟中,CYP7A1的活性與藥物的毒性密切相關[17-18]。PPAR α是由配體激活的轉錄調節因子,參與炎癥反應、凋亡和脂質代謝[19],對藥物性肝毒性等具有調控作用,當激活PPAR α后,會抑制肝細胞缺氧/復氧損傷后SOD和GSH的失活,減少活性氧生成并加速其消除,同時降低細胞內MDA的含量,抑制肝細胞缺氧/復氧損傷的脂質過氧化反應,減輕大鼠肝細胞缺氧/復氧損傷的氧化應激損傷,保護肝臟功能[20]。

本實驗結果顯示,蒺藜粉高劑量組可引起大鼠GOT的顯著升高,而蒺藜水提物高劑量組大鼠GOT、GPT的均顯著升高,表明高劑量的蒺藜粉末和蒺藜水提物均能對大鼠肝臟產生影響,且蒺藜水提物對大鼠肝臟的影響更為嚴重。通過對大鼠肝組織能量代謝相關指標和相關因子檢測表明,蒺藜水提物組大鼠PPAR α表達顯著降低,而CYP7A1、MDA的表達顯著升高。因此,抑制PPAR α表達,促使CYP7A1、MDA的過盛表達可能是蒺藜引起肝毒性的原因之一。而實驗中GSH呈現升高趨勢、SOD未見明顯的變化趨勢,這可能是藥物有效成分對肝臟的影響,具體GSH的升高是否與藥物有效成分有關,還需要進一步研究。

利益沖突聲明:無。