腸桿菌科細菌耐藥基因NDM和ESBLs的檢測及白頭翁湯增強其敏感性研究

摘 要：采用美國臨床實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦的方法，檢測了臨床分離的44株腸桿菌科細菌產超廣譜β-內酰胺酶（Extended-Spectrum Beta-Lactamases，ESBLs）的情況.利用PCR對臨床分離菌進行新德里金屬β-內酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase，NDM）以及ESBLs耐藥基因的檢測.用微量肉湯稀釋法測定了分離菌對阿莫西林等14種抗菌藥的敏感性，并統計其耐藥率.結果表明，臨床分離的44株腸桿菌科細菌中，有31株產超廣譜β-內酰胺酶，檢出率為70.5％.耐藥基因檢測結果顯示，耐藥基因NDM-1攜帶率為13.6%.ESBLs耐藥基因TEM，SHV，CTX-M，OXA的攜帶率分別為100%，43.2%，45.5%，6.8%.同時發現，有6株菌株同時檢出了含NDM-1和ESBLs的基因，有9株菌株同時檢出含有2 種ESBLs基因，3株同時檢出含有3種ESBLs基因.敏感性測定結果顯示，分離菌大多呈現多重耐藥，分離菌除對替加環素（18.2%）和阿米卡星（36.4%）的耐藥率較低外，對其他藥物呈現出較高的耐藥率，其中對阿莫西林的耐藥率高達97.7%，對頭孢曲松、環丙沙星、土霉素、四環素、紅霉素的耐藥率均在75.0%以上.此外發現，同時攜帶多個耐藥基因的菌株耐藥率較高.中藥復方白頭翁湯對分離菌表現出了一定的抑菌活性，其MIC值為204.8 g/L.14種抗菌藥分別與白頭翁湯聯用后，耐藥率均有不同程度下降，其中頭孢類藥物、氟喹諾酮類藥物與白頭翁湯聯用后，耐藥率下降較為明顯，如頭孢曲松由84.1%下降至56.8%，環丙沙星由75.0%下降至45.5%.綜上，NDM和ESBLs耐藥基因在腸桿菌科細菌中已有一定的流行，同時攜帶NDM和ESBLs多個耐藥基因的菌株耐藥較為嚴重.白頭翁湯與抗菌藥聯用能在一定程度增強耐藥菌株的敏感性，為臨床相關感染的防治提供理論依據.

關鍵詞：腸桿菌科;超廣譜β-內酰胺酶；白頭翁湯；藥物敏感性

中圖分類號：R285.5文獻標志碼：A

腸桿菌科細菌是人體正常菌群的重要組成部分，多數為條件致病菌，廣泛存在于人體的體表和腸道中，它在維持腸道菌群平衡方面起著重要作用［1-2］.此外，這類菌也廣泛存在于醫院的環境中，它是引起醫源性感染的重要病原菌，研究發現導致醫院病原菌感染的病例中，有近一半是腸桿菌科細菌導致的感染，可謂危害性極大［3］.2008年，首次在腸桿菌科細菌導致尿路感染的患者中發現了NDM，后被命名為NDM-1型，它屬于一種新型碳青霉烯酶，對包括碳青霉烯類在內的所有β-內酰胺類抗菌藥物耐藥［4］.隨后，該酶在世界范圍內快速播散，給臨床醫療及感染防控帶來了嚴重威脅.ESBLs主要由腸桿菌科細菌產生，大腸桿菌和肺炎克雷伯菌是典型代表，產ESBLs是腸桿菌科細菌對β-內酰胺類藥物耐藥的重要機制［5］.

當前，產NDM和ESBLs的腸桿菌科細菌檢出率居高不下，菌株的耐藥問題變得日趨嚴峻［6］.尋找不易產生耐藥且能恢復耐藥菌株敏感性的藥物迫在眉睫.中藥為中國傳統特有藥物，具有毒副作用小、不易產生耐藥性等特點.同時，很多中藥還可以使已經產生耐藥性的菌株耐藥性降低，從而能夠恢復耐藥菌株對治療藥物的敏感性.中藥復方白頭翁湯（Pulsatillae Decoction，PD），具有抗菌、消炎、鎮痛等藥理作用，可用于防治腸桿菌科細菌導致的感染性疾病.據體外抑菌試驗研究發現，白頭翁湯具有明顯的抑菌作用［7-9］.目前，中藥復方在對產NDM和ESBLs腸桿菌科細菌作用機制方面鮮見報道［10］.此外，白頭翁湯在對產NDM和ESBLs 腸桿菌科細菌恢復敏感性方面缺乏系統研究.鑒于此，本試驗開展腸桿菌科細菌NDM和ESBLs基因檢測、白頭翁湯對產NDM和ESBLs腸桿菌科細菌增強敏感性方面的研究，旨在闡釋白頭翁湯對產NDM和ESBLs 腸桿菌科細菌恢復敏感性的初步作用，為臨床抗感染治療、醫院源產NDM和ESBLs腸桿菌科細菌感染性疾病防控提供科學依據.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

44株已鑒定的腸桿菌科細菌于2020年6至9月由河南中醫藥大學第二附屬醫院檢驗科惠贈，分離自ICU、神經外科和急診科肺部感染患者的痰液標本.菌株組成包括大腸桿菌13株（E1～E13），肺炎克雷伯菌15株（K1～K15），綠膿桿菌10株（P1～P10），不動桿菌6株（A1～A6）.菌株鑒定采用德國布魯克microflex LT 臺式MALDI-TOF基質輔助激光解析飛行時間質譜儀及原裝進口配套試劑，鑒定結果分值均大于2.00.

1.1.2 培養基和試劑

TSA（批號：200620），MH（批號：200426），LB（批號：210215）等培養基購自北京陸橋技術股份有限公司；各種顯色培養基（貨號：PS820，EC166，AC092，TA870）購自法國科瑪嘉公司.2×Taq Master Mix（貨號：CW0682C）等購自北京康為世紀有限公司.

1.1.3 藥敏紙片及藥物

氨曲南（AZT，30 μg/片，批號：20200609）、頭孢他啶（CAZ，30 μg/片，批號：20200712）、頭孢曲松（CRO，30 μg/片，批號：20200910）、頭孢噻肟（CTX，30 μg/片，批號：20210115）、頭孢他啶/棒酸（CAZ/CA，30 μg/片，批號：20200918）和頭孢噻肟/棒酸（CTX/CA，30 μg/片，批號：20210204）購自北京天壇藥物生物技術開發公司.白頭翁、黃檗、黃連、秦皮均購自河南中醫藥大學第三附屬醫院，經河南中醫藥大學代麗萍教授鑒定為毛茛科植物白頭翁Pulsatilliae Radix的 干 燥 根、蕓香科植物黃檗Phellodendri Chinrnsis Cortex的干燥根、毛茛科植物黃連Coptidis Rhizoma的干燥的根、木樨科植物苦櫪白蠟樹Fraxini Cortex的干燥的根.常用抗菌藥物阿莫西林（Amoxicillin，貨號：S26864）、頭孢曲松（Ceftriaxone，貨號：B24430）、頭孢他啶（Ceftazidime，貨號：B70108）、頭孢吡肟（Cefepime，貨號：T48283）、美羅培南（Meropenem，貨號：S31659）、環丙沙星（Ciprofloxacin，貨號：S17012）、左氧氟沙星（Levofloxacin，貨號：S17134）、阿米卡星（Amikacin，貨號：S37556）、土霉素（Terramycine，貨號：B34615）、多西環素（Doxycyclin，貨號：S27317）、四環素（Tetracycline，貨號：S17051）、替加環素（Tigecycline，貨號：S24031）、紅霉素（erythromycin，貨號：S17002）和林可霉素（Lincomycin，貨號：B33847）為標準品或對照品，購自上海源葉生物科技有限公司，均在有效期內.

1.2 方法

1.2.1 腸桿菌科細菌菌株復蘇以及ESBLs表型檢測

菌株復蘇：無菌劃線接種于血平板上，37 ℃培養12～16 h，后挑取單菌落接種LB肉湯培養基，再培養12～16 h，而后再次劃線接種于顯色培養基上純培養，作為受試菌株.

ESBLs檢測：按照CLSI［11］推薦的ESBLs初篩和表型確證試驗，重復3次，取平均值.

1.2.2 耐藥基因NDM，ESBLs檢測

對NDM和ESBLs耐藥基因進行PCR擴增（見表1）.反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性45 s，72 ℃延伸45 s，循環30次，最后72 ℃延伸10 min.PCR擴增后分別取7 μL產物進行電泳，利用凝膠成像系統觀察結果.PCR擴增陽性的基因，經測序驗證.

1.2.3 敏感性試驗檢測

1.2.3.1 藥液配制

精確稱取各抗菌藥物溶解于無菌水中，配成質量濃度為1 280 mg/L的儲備液，-20 ℃保存，備用.白頭翁湯儲備液的配制：按照白頭翁湯組方比例取4味藥材90 g，加入6倍體積水浸潤，然后添加10倍體積的水加熱煮沸，煮沸后改文火煎煮1 h;過濾，濾渣再加8倍體積水煎煮1 h;過濾，取上清液，合并2次藥液，減壓濃縮為43.95 mL，即質量濃度為2 048 g/L的儲備液，5 000 r/min離心15 min;取上清液，再次離心取上清液，流通空氣滅菌20 min，-20 ℃保存，備用.

1.2.3.2 菌液準備

挑取純培養菌液接種MH肉湯，于37 ℃過夜培養，挑取3～5個純菌落于5 mL去離子水中，經比濁使其達到0.5麥氏單位（約為1×108 cfu/mL），使用前將菌液稀釋1 000倍.

1.2.3.3 藥物敏感性測定

采用微量稀釋法，測定阿莫西林等14種抗菌藥物和白頭翁湯的最小抑菌濃度（MIC），再分別測定以上14種藥物與白頭翁湯（1/2MIC）聯用的MIC.替加環素耐藥臨界值按照歐洲藥物敏感性檢測委員會（EUCAST）標準［13］來判讀，其余抗菌藥物耐藥臨界值CLSI標準［11］來判讀.此后，進行耐藥率統計.

2 結果與分析

2.1 ESBLs檢測結果

根據初篩試驗結果，13株大腸桿菌菌株均為疑似產ESBLs菌株；15株肺炎克雷伯菌菌株除K9外，其余14株為疑似產ESBLs菌株；10株綠膿桿菌菌株除P3外，其余9株為疑似產ESBLs菌株；6株綠膿桿菌菌株除A4，A5外，其余4株為疑似產ESBLs菌株.可見，44株受試菌株中除K9，P3，A4，A5菌株外，其余40株為疑似產ESBLs菌株.

40株疑似產ESBLs菌株的表型確證結果（表2）.40株疑似產ESBLs菌株中有31株被確認為產ESBLs菌株，檢出率為70.5%.

2.2 耐藥基因NDM和ESBLs檢測結果

耐藥基因在44株腸桿菌菌株中有不同程度的檢出，金屬β-內酰胺酶耐藥基因NDM-1攜帶率為13.6%，其中，在大腸桿菌、綠膿桿菌、不動桿菌菌株中均有檢出.ESBLs耐藥基因TEM，SHV，CTX-M，OXA的攜帶率分別為100%，43.2%，45.5%，6.8%，其中耐藥基因TEM在44株腸桿菌菌株中被全部檢出，耐藥基因OXA的檢出率較低（6.8%）.同時還發現有6株菌株同時檢出了含NDM-1，ESBLs的基因，有9株菌株同時檢出含有2 種ESBLs基因，3株同時檢出含有3種ESBLs基因.部分菌株耐藥基因檢測結果見圖1至圖4.

2.3 敏感性試驗測定結果

MIC結果顯示，分離株大多呈現多重耐藥，尤其大腸桿菌、肺炎克雷伯菌和綠膿桿菌耐藥較為嚴重.中藥復方白頭翁湯對腸桿菌科細菌具有一定的抑菌活性，其MIC值為204.8 g/L.由表3可知，分離株除對替加環素（18.2%）和阿米卡星（36.4%）的耐藥率較低外，對其他藥物呈現出較高的耐藥率，其中對阿莫西林的耐藥率高達97.7%，對頭孢曲松、環丙沙星、土霉素、四環素、紅霉素的耐藥率均在75%以上，對林可霉素、多西環素、左氧氟沙星、美羅培南、頭孢他啶的耐藥率也在50%以上.此外發現，同時攜帶多個耐藥基因的菌株耐藥率較高.

由表3顯示，14種抗菌藥分別與白頭翁湯聯用后，耐藥率均有不同程度下降，其中頭孢類藥物、氟喹諾酮類藥物與白頭翁湯聯用后，耐藥率下降較為明顯，如頭孢曲松由84.1%下降至56.8%，環丙沙星由75.0%下降至45.5%.

3 討 論

腸桿菌科細菌是廣泛存在于自然界的條件致病菌，同時又是醫源性感染的重要病原菌.當機體免疫功能受損或寄居條件發生改變時，腸桿菌科細菌便大量增殖，繼而能引起感染.據相關報道，腸桿菌科細菌中檢出率最高的是大腸桿菌和肺炎克雷伯菌，也是產ESBLs的常見菌株［14-15］.隨著抗菌藥物廣泛應用于臨床，耐藥菌株日趨呈上升態勢，特別是腸桿菌科細菌中產NDM和ESBLs菌株日益增多，這給臨床感染的防治帶來了巨大挑戰.因此，及時掌控產酶菌株的流行和耐藥特征，有效防止耐藥菌株在醫院的感染及流行具有重要意義.

本試驗ESBLs檢測采用CLSI推薦方法，具有方便、快速、特異性較高等優點，適合實驗室和臨床推廣檢測使用.ESBLs是能水解青霉素類、頭孢菌素類等藥物，但能被β-內酰胺酶抑制劑如舒巴坦、克拉維酸所抑制的一類酶［16-17］.本研究發現產ESBLs的檢出率70.5%，這高于文獻［18］報道的產ESBLs大腸桿菌檢出率42.19%.另據研究得知，從798株腸桿菌中檢出產ESBLs菌株160株，檢出率為20.05%.其中，大腸桿菌的檢出率為61.25%（98/160）［19］.

本研究顯示，耐藥基因NDM-1在大腸桿菌、綠膿桿菌、不動桿菌菌株中均有檢出，攜帶率為13.6%，這與以往報道檢出結果相一致［20-21］.據崔小璠等［22］研究發現，從178株耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌菌株中檢出產NDM菌株22株，檢出率為12.4%.另有研究發現，從153株腸桿菌科細菌菌株中檢出產NDM菌株2株，檢出率為1.3%［23］.ESBLs的基因型種類較多，按照同源性可分為TEM，SHV，CTX-M，OXA等多種型別［24］.本試驗發現，ESBLs耐藥基因中檢出率最高的是TEM型（100%），這與曾利娟［2］研究報道檢出率最高的是CTX-M型（81%）有一定差異，推測可能是不同地區、不同醫院的菌株流行的ESBLs基因型存在一定差異，或可能與本試驗受試菌株的數量以及與不同地區、不同醫院抗生素的使用情況不同有一定關系，后續應加大樣本量進一步研究.本研究還發現，有部分菌株同時攜帶了NDM-1和ESBLs的基因，在同一菌株發現了含2 種以上ESBLs基因，這從中揭示了產NDM和ESBLs腸桿菌科細菌所含耐藥基因存在一定的復雜性，這警示我們在臨床中應合理用藥，并及時加強耐藥性檢測.

近年來，關于腸桿菌科細菌的耐藥性報道較多，本研究發現，分離菌株大多呈現多重耐藥，這與有關報道結果一致［25-26］.本研究顯示腸桿菌科細菌對常用抗菌藥物呈現出較高的耐藥率，這與文獻［18，27］結果一致.研究發現產ESBLs的腸桿菌菌株對阿莫西林、頭孢曲松的耐藥率達79%，產ESBLs的腸桿菌菌株出現多重耐藥的比例達47%［28］.另有研究發現產ESBLs菌株耐藥現象嚴重，其中大腸桿菌對四環素的耐藥率超過70%，肺炎克雷伯菌對氨芐西林耐藥率幾乎達100%［2］.同時，也警示我們在治療腸桿菌科細菌引起相關感染時應慎用或停止使用這些藥物.研究發現用替加環素對多重耐藥的腸桿菌菌株進行體外抗菌活性測定時，替加環素對肺炎克雷伯菌的耐藥率為6.7%［29］.產ESBLs菌株（大腸桿菌和肺炎克雷伯菌）對美羅培南和阿米卡星的耐藥率都在8%以下［2］.目前，雖然替加環素對多重耐藥的腸桿菌菌株具有良好的抗菌活性，也應注意在使用時必須謹慎，同時做好耐藥性的監測.此外，不同地區、不同醫院來源的病原菌分布存在一定差異，這可能與該地區、該醫院所使用的抗菌藥物種類有一定關聯.同時，產NDM和ESBLs腸桿菌科細菌的分離率、耐藥率和攜帶基因因不同地區、不同醫院也存在一定差異［30］.本研究還發現，同時攜帶多個耐藥基因的菌株耐藥率較高.細菌攜帶多個耐藥基因，具有不同的耐藥表型，表現出一定的多種耐藥［31］.總之，產NDM和ESBLs菌株的出現給臨床治療帶來一定難度.

本研究發現，中藥復方白頭翁湯對腸桿菌科細菌表現出了一定的抑菌活性，與抗菌藥聯用能在一定程度增強耐藥菌株的敏感性.所以在臨床使用抗菌藥物防治相關感染性疾病效果不好或無效時，不妨考慮使用中藥與西藥聯合的方案，以求增效或恢復敏感性.此外，還可將β-內酰胺類藥物與酶抑制劑，如克拉維酸、舒巴坦等聯合用藥.此外，在臨床用藥時要注意，盡量不要長期使用某一藥物，應選用敏感或高敏的藥物，有條件時最好做藥敏試驗，還應考慮交叉用藥或定期輪換用藥等方法.

參 考 文 獻

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Detection of resistance gene NDM and ESBLs of Enterobacteriaceae and study on its sensitivity enhanced by Pulsatilla decoction

Xu Erping1a， Liu Baoguang1a， Dong Ying1a， Bai Ming1a， Xie Miao1b， Wang Baoying1a， Wu Hua2， Li Yongwei1c

（1. a. Academy of Chinese Medical Sciences; b. College of Traditional Chinese Medicine; c. The Second Affiliated Hospital，

Henan University of Chinese Medicine， Zhengzhou 450046， China; 2. College of Veterinary Medicine，

Henan Agricultural University， Zhengzhou 450002， China）

Abstract： Extended-Spectrum Beta-Lactamases（ESBLs）-producing from 44 strains of Enterobacteriaceae were detected by using the method recommended by the Clinical and Laboratory Standards Institute（CLSI）. New Delhi metallo-β-lactamase（NDM）and ESBLs resistance genes were detected in clinical isolates by PCR. The susceptibility of the isolates to 14 kinds of antibacterial drugs such as amoxicillin was determined by the micro-broth dilution method， and the resistance rate was calculated. The results showed that among the 44 strains of Enterobacteriaceae， 31 strains produced ESBLs， and the detection rate was 70.5%. The results of resistance gene detection showed that the carrier rate of resistance gene NDM-1 was 13.6%. The carrier rates of ESBLs resistance genes TEM， SHV， CTX-M and OXA were 100%， 43.2%， 45.5% and 6.8%， respectively. At the same time， it was found that 6 strains were detected with NDM-1 and ESBLs genes， 9 strains were detected with 2 ESBLs genes， and 3 strains were detected with 3 ESBLs genes. The results of susceptibility testing showed that most of the isolates showed multi-drug resistance， and the isolates showed high resistance rates to other drugs except for tigecycline（18.2%）and amikacin（36.4%）. Among them， the resistance rate to amoxicillin was as high as 97.7%， and the resistance rate to ceftriaxone， ciprofloxacin， oxytetracycline， tetracycline and erythromycin were all above 75.0%. In addition， it was found that the strains carrying multiple resistance genes at the same time had a higher resistance rate. The traditional Chinese medicine compound Pulsatilla Decoction showed a certain antibacterial activity against the isolated bacteria， and its MIC value was 204.8 g/L. After 14 kinds of antibacterial drugs were used in combination with Pulsatilla Decoction， the drug resistance rates decreased to varying degrees. Among them， cephalosporins and fluoroquinolones were used in combination with Pulsatilla Decoction， and the drug resistance rates decreased significantly. For example， ceftriaxone dropped form 84.1% to 56.8%， and ciprofloxacin dropped from 75.0% to 45.5%. In conclusion， NDM and ESBLs resistance genes have been prevalent in Enterobacteriaceae， and strains carrying multiple NDM and ESBLs resistance genes are more resistant. The combination of Pulsatilla Decoction and antibacterial drugs can enhance the sensitivity of resistant strains to a certain extent， providing a theoretical basis for the prevention and treatment of clinically related infections.

Keywords： Enterobacteriaceae; ESBLs; pulsatilla decoction; antimicrobial susceptibility

［責任編校 劉洋 楊浦］

收稿日期：2022-01-07;修回日期：2022-04-21.

基金項目：國家自然科學基金（81973739）；河南省中醫藥科學研究專項課題（2019ZY1019；20-21ZY2144）；河南省自然科學基金（222300420481）.

作者簡介：許二平（1962-），男，河南鄢陵人，河南中醫藥大學教授，博士，博士生導師，主要從事仲景方藥配伍及作用機制研究，E-mail：xuerping0371@163.com.

通信作者：許二平;劉保光，E-mail：liubaoguang83@sina.com.