結直腸癌組織微衛星不穩定狀態與其臨床病理特征的關系

【摘要】 目的：探討結直腸癌組織微衛星不穩定（MSI）狀態與病理特征的關系。方法：納入江西省中西醫結合醫院2017年1月-2022年1月收治的結直腸癌患者89例開展回顧性研究，經多重熒光聚合酶鏈式反應（PCR）法對結直腸癌組織的微衛星狀態進行檢測，記錄MSI、微衛星穩定（MSS）狀態的檢出情況，分析MSI與患者病理特征的關系。結果：在89例患者中，錯配修復（MMR）蛋白表達缺失率為38.20%（34/89），未缺失率為61.80%（55/89），MSI占比為39.33%（35/89），MSS占比為60.67%（54/89），患者微衛星狀態與MMR蛋白表達有相關性（Plt;0.05）。患者MSI與年齡、腫瘤部位、分化程度、腫瘤最大徑、癌結節、淋巴結轉移、遠處轉移相關（Plt;0.05）。結論：結直腸癌患者MSI除與年齡有關外，還具備獨特的病理特征，以右半結腸、中低分化、腫塊大及無癌結節、無淋巴結轉移、無遠處轉移的患者居多，能為該病評估提供參考。

【關鍵詞】 結直腸癌 微衛星不穩定狀態 病理特征 多重熒光聚合酶鏈式反應

The Relationship between Microsatellite Instability and Clinicopathological Features in Colorectal Cancer Tissue/CHEN Minyang. //Medical Innovation of China， 2023， 20（17）： -140

[Abstract] Objective： To investigate the relationship between microsatellite instability （MSI） status and pathological features in colorectal cancer tissues. Method： A retrospective study was carried out on 89 patients with colorectal cancer admitted to Jiangxi Provincial Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine from January 2017 to January 2022. The microsatellite status of colorectal cancer tissue was detected by multiplex fluorescence polymerase chain reaction （PCR） method， the detection of MSI and microsatellite stable （MSS） status was detected， and the relationship between MSI and pathological characteristics of patients was analyzed. Result： Among 89 patients， MMR protein expression deletion rate was 38.20% （34/89）， non-deletion rate was 61.80% （55/89）， MSI accounted for 39.33% （35/89）， and MSS accounted for 60.67% （54/89）， Microsatellite status was correlated with the expression of MMR protein （Plt;0.05）. MSI was correlated with age， tumor location， degree of differentiation， maximum tumor diameter， cancer nodules， lymph node metastasis and distant metastasis （Plt;0.05）. Conclusion： MSI in colorectal cancer patients is not only related to age， but also has unique pathological characteristics， such as right colon， medium and low differentiation， large mass， no cancer nodules， no lymph node metastasis， no most patients with distant metastasis can provide reference for the evaluation of the disease.

[Key words] Colorectal cancer Microsatellite instability Pathological features Multiplex fluorescence polymerase chain reaction

First-author's address： Jiangxi Provincial Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine， Nanchang 330003， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2023.17.032

結直腸癌是臨床常見的消化道腫瘤，在我國惡性腫瘤中發病率位居第3位，死亡率居于第5位[1]。目前，臨床對于該病仍采用手術治療為主，放療、化療為輔的方式，雖然有一定應用價值，但部分患者術后仍然存在遠處轉移、復發的情況，療效欠佳[2]。因此，臨床還需為該病的個體化治療提供新方向。結直腸癌的發病機制非常復雜，例如抑癌基因表達缺失或者突變，癌基因表達過度或激活，均可促進腫瘤發生[3]。近年來，研究發現DNA錯配修復（mismatch repair，MMR）蛋白表達缺失或編碼基因突變所致的微衛星不穩定（microsatellite instability，MSI）狀態與腫瘤病情變化有關，MMR蛋白包括PMS2、MSH2、MLH1及MSH6蛋白，若編碼上述蛋白的相關基因出現突變，或者MMR蛋白缺失，則無法對DNA復制時造成的錯配進行修復，引起MSI[4]。所謂MSI，即與正常組織比較，腫瘤病灶組織內某微衛星因復制差錯，致使簡單重復序列缺失或插入，改變微衛星長度，可見結構性等位基因大小改變，有新微衛星等位基因出現[5]。而既往研究指出，約15%結直腸癌發病與MSI相關[6]。通過分析MSI狀態與結直腸癌病理特征的關系，能進一步掌握該病的特點，為臨床干預提供新的治療方向。本研究則納入89例結直腸癌患者對此進行探討，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入江西省中西醫結合醫院病理科2017年1月-2022年1月收治的結直腸癌患者89例開展回顧性研究。納入標準：年齡≥18歲；一般資料與病理資料齊全；首診。排除標準：術前有放療史、化療史；同時患其他原發性腫瘤；既往有腦血管、心血管疾病病史；患自身免疫性疾病、血液系統疾病；凝血功能異常。在89例患者中，男48例，女41例，年齡30～95歲，平均（59.63±10.72）歲。研究方案獲醫學倫理委員會批準。

1.2 檢測方法 通過手術獲取癌組織及癌旁正常腸黏膜組織，經多重熒光聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）法測定MSI狀態，經免疫組化S-P法測定癌組織中MMR蛋白表達情況。

1.2.1 主要試劑與儀器 主要試劑包括DNA提取試劑、微衛星不穩定性檢測試劑，購自德國Qiagen公司，DAB顯色試劑、抗原修復液、蘇木素染色液及PMS2、MSH2、MLH1與MSH6單克隆抗體，購自福州邁新生物工程公司。主要儀器包括YT-7FB型組織攤烤片機（湖北亞光醫用電子技術有限公司）、YB-8LF型包埋機（湖北亞光醫用電子技術有限公司）、LEICA ASP300S型全自動組織脫水機（德國Leica公司）。

1.2.2 MMR蛋白表達檢測 獲取樣本組織后，通過10%甲醛予以固定，脫水，行石蠟包埋，切片，厚度約4 μm。將切片置于涂膠玻片，常規烤片、脫蠟，行高壓抗原修復，將切片放置于耐高溫染片架，然后放入高壓鍋（裝有抗原修復液）內加熱，直至沸騰，冒氣5～10 min后，自然冷卻10 min，利用自來水對不銹鋼鍋外壁進行沖淋，直至冷卻，將切片取出，流水洗3 min，經PBS溶液洗3次，

3 min/次。取內源性過氧化物酶阻斷劑100 μL加入，室溫孵育10 min，經PBS溶液洗3次，3 min/次。加一抗100 μL，室溫孵育1 h，經PBS溶液洗3次，3 min/次。加酶標聚合物100 μL，室溫孵育

15 min，PBS溶液清洗同上。加DAB顯色液100 μL，室溫孵育5 min。經自來水清洗，行蘇木素復染，時間為20 min，經自來水返藍。常規脫水、透明、封片。結果判定：若胞核內呈棕黃、黃褐色顆粒，則提示PMS2、MSH2、MLH1及MSH6陽性。根據染色強度計分：無著色、淡黃、棕黃、棕褐色分別計0、1、2、3分。按陽性細胞占比計分：陽性細胞占比≤10%、11%～50%、51%～75%、gt;75%分別計1、2、3、4分。兩項乘積≥2提示陽性，否則為陰性。四種蛋白表達均為陽性，則為MMR陽性（無表達缺失），任意一種蛋白表達為陰性，則為MMR陰性（表達缺失）[7]。

1.2.3 MSI狀態檢測 獲取樣本組織后，通過DNA提取試劑對癌組織、癌旁組織DNA進行提取，參考美國國家癌癥研究所用藥協議小組推薦的指南，選取微衛星位點，正向、反向引物序列如下：D2S123為5'-ACACAGAGCCTTAGTA-3'、5'-GGATTAGAAAGACAAGT-3'；D17S250為5'-GCTAATTGTTAAACTGGAT-3'、5'-ACTGGATATTCTAGTTAGT-3'；D5S346為5'-ACTCTTCATTATGGGTCAAG-3'、5'-AGAGTCAAGTATTATGGTT-3'；Bat-25為5'-TGGTAGTAATGCTGCCGAT-3'、5'-GGATAGTTGTCACTGTT-3'；Bat-26

為5'-TGACTACTTTGACTTCAGCC-3'、5'-AACCATTCAACATTTTTAACCT-3'。反應條件：95 ℃ 15 min（預變性）；94 ℃ 60 s（變性），56 ℃ 60 s（退火），56 ℃ 60 s（延伸），30個循環。待微衛星片段擴增完畢，經95 ℃ 5 min變性，行毛細血管電泳，將數據輸入配套軟件進行處理。結果判定：與正常組織相比，癌組織所測定的位點未見等位基因異常與移動，則為微衛星穩定（microsatellite stable，MSS），癌組織測定的位點可見數目改變或波峰移動，視為MSI，在所檢測的5個位點中，不穩定位點≥2個，視為高度不穩定（microsatellite stable-high，MSI-H），僅1個位點不穩定，則為低度不穩定（microsatellite stable-low，MSI-L）[8]。根據患者的微衛星狀態分成MSS組與MSI組（包含MSI-H與MSI-L）。

1.2.4 一般資料與病理資料收集 一般資料包括性別、年齡、體重指數、吸煙史、飲酒史、家族史，病理資料包括腫瘤部位、分化程度、腫瘤大小、病理形態、脈管侵犯、癌結節、淋巴結轉移、神經侵犯、遠處轉移。

1.3 統計學處理 利用SPSS20.0軟件處理數據，計數資料用率（%）表示，行字2檢驗。經字2檢驗分析微衛星狀態與MMR蛋白表達的相關性。Plt;0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 89例患者的MMR蛋白表達分析 在89例患者中，有34例（38.20%）存在MMR蛋白表達缺失，55例（61.80%）未見表達缺失，具體表達缺失情況，見表1。

2.2 89例患者微衛星狀態與MMR蛋白表達的相關性 在89例患者中，MSI 35例（39.33%），MSS 54例（60.67%）。在35例MSI患者中，MSI-L 1例，MSI-H 34例，僅1例MMR蛋白表達未缺失，54例

MSS患者的MMR蛋白表達均未缺失。采用字2檢驗分析微衛星狀態與MMR蛋白表達有相關性（字2=84.885，Plt;0.001），見表2。

2.3 患者微衛星不穩定狀態與一般資料的關系 在89例患者中，MSI組年齡lt;60歲占比高于MSS組（Plt;0.05），其余一般資料兩組比較差異均無統計學意義（Pgt;0.05），見表3。

2.4 患者微衛星不穩定狀態與病理特征的關系 MSI

組腫瘤部位位于右半結腸、中低分化、腫瘤最大徑≥5 cm占比均高于MSS組，癌結節、淋巴結轉移、遠處轉移占比均低于MSS組（Plt;0.05）。兩組病理形態、脈管侵犯、神經侵犯及病理類型比較，差異均無統計學意義（Pgt;0.05）。見表4。

3 討論

結直腸癌的發病機制主要為染色體不穩定（chromosomal instability，CIN）與MSI兩種通路，其中MSI與MMR基因存在密切關聯，在MMR系統正常的情況下，其能對DNA復制時出現的錯配、插入、缺失進行修復，確保人類遺傳物質的保真性及穩定性，一旦MMR系統功能下降或喪失，則會產生錯配修復缺陷，引起MSI[9]。近年來，已有大量研究證實MSI與多種腫瘤疾病相關，如子宮內膜癌、胃癌、膽囊癌等[10-12]。有研究指出在出現MSI的惡性腫瘤患者中，DAN錯義突變與移碼發生風險增高100～1 000倍，基因組內短串聯重復序列異常，出現減少或增加的現象，大量抑癌基因或者原癌基因突變，致細胞調控處于失衡狀態[13]。因此，臨床有必要掌握MSI與結直腸癌病理特征的關系，為該病診治提供依據。

本次結果顯示，在89例患者中，MMR缺失率為38.20%，MSI比例為39.33%。有學者發現在141例結直腸癌患者中，MSI-H占比為17.7%，MSI-L占比為12.1%，MSI共計占比為29.8%[14]，略低于本次結論，分析原因，考慮到主要與患者的個體差異相關，由于個體的疾病特征不同，微衛星狀態可能會出現差異。本次還發現MMR與微衛星狀態之間存在相關性，進一步提示MMR與MSI存在相關性。在MMR蛋白中，MLH1、MLH2是參與錯配修復的主要組成部分，二者能結合于其同源錯配修復蛋白，合成二聚體，從而發揮相關作用[15]。MSH6是MLH2的配對蛋白，PMS2是MLH1的配對蛋白，一旦二者產生突變，則會降解其對應的二聚體蛋白，引起主導蛋白及其配對蛋白缺失，而MMR蛋白的缺失會導致MSI[16]。該機制能夠為本次結論提供解釋。本研究發現在35例MSI患者中，有1例MMR蛋白并未缺失，這可能與某些未知的錯義突變導致MMR抗原性保留，但其功能卻喪失有關，未來還有待進一步驗證。

結直腸癌患者的病理特征多樣，病理特征不同，對疾病進展與預后的影響也不同[17-18]。本次結果提示，結直腸癌患者的微衛星狀態與多種病理特征存在關聯，其中MSI患者的主要特征為年齡lt;60歲、右半結腸、中低分化、腫塊較大，且癌結節、淋巴結轉移及遠處轉移率更低。本研究顯示發生MSI患者的年齡相對較小，但關于其機制尚未徹底明確。研究發現與MLH1超甲基化患者相比，MMR基因胚系突變患者相對年輕[19]，這可能是MSI與年齡產生關聯的原因。MSI以右半結腸癌患者多見，表明不同腫瘤部位患者的基因水平存在差異，這類結直腸癌發生可能主要與DNA復制錯誤所致的腫瘤基因突變有關，而其他部位結直腸癌的發生則可能與雜合性缺失所致的抑癌基因、促癌基因突變有關。本研究顯示與MSI相關的病理特征既包括正面特征，也包括負面特征，正面特征為癌結節、淋巴結轉移與遠處轉移率低，負面特征為分化程度相對低、腫塊大。研究表明MSI患者容易出現腫瘤細胞突變，這種突變可增加腫瘤新抗原，有利于CD8+T細胞對腫瘤細胞進行識別并殺傷[20]。因此，從理論上而言，即便MSI患者分化程度較低、腫塊大，但仍然大多不伴有癌結節、淋巴結轉移與遠處轉移。

綜上所述，結直腸癌患者MSI與多種病理特征有關，其中既包括有利特征，也包括不利特征，臨床需引起重視。但本研究也有不足，如選取的樣本較少，受研究時間限制，未能進一步隨訪分析預后，未來將增加樣本量觀察患者的預后情況。

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（收稿日期：2022-09-20） （本文編輯：田婧）