水晶蜜柚果實無籽機理細胞學研究

摘 要：【目的】水晶蜜柚原產于馬來西亞，是海南柚類的主栽品種之一，但有關水晶蜜柚果實無籽的原因未見報道，探究水晶蜜柚果實無籽原因可為蜜柚高效栽培和育種提供理論依據。【方法】從水晶蜜柚的花粉活力與萌芽率、花粉母細胞減數分裂，花粉管伸長熒光顯微觀察、雜交實驗、胚胎胚囊石蠟切片觀察等細胞學角度研究水晶蜜柚果實的無籽機理。【結果】水晶蜜柚活力強的花粉76.58%，萌芽率88.48%；花粉母細胞減數分裂正常，但出現異常二分體和三分體現象；水晶蜜柚雜交的花粉管能伸長至子房并到達胚珠，完成受精作用，而自交的花粉管只能伸長到花柱中下部，到達不了子房，不能完成受精作用；水晶蜜柚胚胎胚囊石蠟切片顯示不做處理和自交的胚胎發育一致，前期發育正常，能觀察到胚胎從幼胚發育到魚蕾形胚，魚雷形胚時胚囊出現中空異常狀態，珠柄消失；雜交的胚胎能從幼胚正常發育到子葉胚，珠柄未消失，有發育成種子的跡象；水晶蜜柚與三紅蜜柚雜交的坐果率為21%，其自交和去雄套袋不授粉的坐果率只有3% 和2%；雜交所得的果實的種子為飽滿可育的種子，其自交和去雄套袋不授粉的種子為敗育和退化的種子。【結論】水晶蜜柚花粉育性正常，花粉母細胞減數分裂正常，胚囊正常可育，水晶蜜柚無籽的原因是自交不親和且具有單性結實能力。

關鍵詞：水晶蜜柚；無籽機理；花粉管伸長；胚胎發育

中圖分類號：S667 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981（2023）04—0209—09

柚Citrus maxima（Burm.）Merr 屬蕓香科柑橘屬喬木植物，是柑橘類中最大的水果，同時也是柑橘中重要的一類果實[1]。水晶蜜柚原產于馬來西亞，在海南省澄邁縣種植，具有無籽、皮薄、肉質細嫩、汁液豐富、香甜可口等優良性狀，以其“無籽”著稱，又名“無籽蜜柚”，成為海南柚類重要的栽培品種之一[2]，水晶蜜柚不僅含有豐富的營養物質，而且耐儲存、上市時間早，深受廣大消費者喜愛，具有明顯的市場優勢。無籽是鮮食蜜柚的一個優良性狀，也是新品種選育的目標之一。

據相關文獻報道，引起柑橘果實無籽的原因包括雄性不育、雌性器官不育、胚胎敗育、自交不親和性和單性結實[3]。

雄性不育是指植物在發育過程中雄性器官發育不完全導致的形態和功能異常。雄性不育可分為核雄性不育（MS）和細胞質雄性不育（CMS）[4]。導致雄性不育的主要因素是花藥及花粉母細胞退化、減數分裂不正常和環境因素[5]。溫州蜜柑在減數分裂時出現異常，形成的花粉量不僅少而且多為干癟敗育的花粉[6]。黔陽無核大紅甜橙[7]、無核甌柑[8]、無核（少核）紅江橙[9] 等品種的無核性都是因為雄性不育。

植物受精和產生種子的場所都在胚囊，胚囊發育是否正常關系到種子是否能形成。當胚囊出現敗育和花器官形態外部出現異常時植物雌性器官表現不育，果實無核。大多數柑橘品種都存在著不同程度的胚囊敗育現象[10]。麗椪2 號果實出現無核是因為胚囊發育過程中表現為高度敗育，胚囊敗育在四核時期，沒有觀察到分裂為八核期的胚囊[11]；桂林良豐無核椪柑也是果實胚囊發育到四核期時出現敗育[12]；特晚熟紅桔JZT（P）-1果實在發育過程中胚珠中的孢原細胞、胚囊原始細胞和不同發育程度的胚囊都出現了敗育現象，導致果實無核[13]。

植物雌雄蕊都正常發育，授粉受精后合子在發育過程中發生異常，從而引起胚胎敗育形成無核果的現象稱為胚胎敗育。江西椪柑無核的原因有3 點，一是雄配子減數分裂時異常，二是自交時出現了胚胎敗育，三是與鄂柑一號雜交時也出現了胚胎敗育[14]；南豐蜜橘果實無核則是由于合子胚在自交和雜交授粉4 周后出現了敗育[15]；無核貢柑和安農無核蜜香柚果實無核的原因也是胚胎敗育造成的[16-17]。

自交不親和（Self-incompatibility，SI）是開花植物防止自交受精和近親繁殖的重要機制。與煙草、油菜、甘藍、罌粟等模式植物相比，果樹因其生長周期長、雜合度較高，SI 分子研究相比較遲緩。近年來，分子生物技術快速發展，果實SI 分子機制研究取得了很大成果。有研究表明薔薇科、蕓香科等果樹自交不親和的雌性決定因子是S-RNase[18]，雄性決定因子是SLF 和SFB 兩個F-box 基因[19]。S-RNase 基因和SLF 基因可以相互作用，兩者分別在花柱和花粉中特異表達。如果花粉F-box 基因與花柱S-RNase 基因相碰撞，花粉會分泌S-RNase來降解花粉管的RNA，導致花粉管在花柱無法生長，從而表現為不親和性反應；如果花粉F-box 基因與花柱S-RNase 基因不相碰撞，花粉就不會分泌S-RNase，花粉管則能穿過柱頭到達子房完成受精，這時表現為半親和性反應或完全親和反應[20]。

除了上述原因外，單性結實和染色體數目變異也是導致柑桔果實無籽的原因[10]。

果實無籽是水晶蜜柚和其他柑橘的優良性狀之一。目前，未見有關澄邁水晶蜜柚無籽原因的報道，其S 基因型也未鑒定。為了更好地利用水晶蜜柚種質，首先從細胞學角度分析其無籽的具體原因。以澄邁水晶蜜柚和三紅蜜柚為實驗材料，水晶蜜柚花期與三紅蜜柚花期相近，三紅蜜柚花粉預實驗表明其花粉有活力能正常萌發，且三紅蜜柚S 基因型已被鑒定，其S 基因型為S8S9[21]。下一步可以在分子生物學水平繼續探索其無籽性狀的分子機理，篩選與無籽相關的基因，豐富柚類無籽的理論基礎和實驗證據，為全面認識水晶蜜柚無籽機理奠定基礎。因此，研究水晶蜜柚無籽的原因，對豐富柑橘無籽的理論依據和育種者在實際工作中使用這一性狀具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

以種植于海南省澄邁縣洪安蜜柚基地的水晶蜜柚（無籽）和種植于海南省澄邁縣海膠閩星基地的三紅蜜柚為試驗材料。于2021 年2 月7 日采集數朵含苞待放的水晶蜜柚健康花蕾、不同直徑大小的花苞、授粉后的雌蕊和數朵含苞待放的三紅蜜柚健康花蕾帶回實驗室，備用。

1.2 方 法

1.2.1 花粉育性相關指標測定

1）花粉活力測定：將采集到的2 種健康花蕾剝開，取2 ～ 3 枚花藥于載玻片上，加1 滴蒸餾水，用鑷子將花藥搗碎，使花粉釋放，再加1-2 滴I2-KI 溶液（1g I2，2 g KI/300 ml），蓋上蓋玻片，用濾紙吸走多余的染液，在顯微鏡下觀察。根據染色后花粉粒的顏色來判斷花粉活力，活力強的花粉顏色呈藍黑色，活力弱或內含物少的花粉呈黃褐色，沒有活力的花粉則為無色。重復3 次，每個重復制作5 個玻片，每個玻片取5 個視野觀察統計，每個視野不少于30 粒花粉粒[22]。

2）花粉萌芽率測定：花粉培養基選用固體培養基，固體培養基選用1% 瓊脂、0.01% 硼酸和10% 蔗糖進行配制，將適量花粉均勻涂抹在固體培養基表面，在25±2°C條件下培養48 h 后觀察，重復3 次，以花粉管長度大于花粉直徑作為萌發的標志，統計萌發的花粉數量[23]。

1.2.2 花粉母細胞減數分裂觀察

于水晶蜜柚現蕾期晴天上午采集發育正常、不同直徑大小的花苞，用新鮮配制的卡諾固定液（無水乙醇∶冰乙酸=3∶1）進行固定12 h 以上，然后置于70% 乙醇4℃保存備用。取出保存的花蕾，用濾紙吸去多余保存液，鑷子挑出2 ～ 3 枚花藥置于載玻片上，加入1 滴改良卡寶品紅染色液，用鑷尖輕輕搗碎花藥，去除殘渣后，蓋上蓋玻片，再蓋上1 張濾紙，用拇指均勻用力輕輕擠壓，使分裂相分散，選擇不同時期分裂相典型的花粉母細胞在光學顯微鏡下觀察，觀察30 ～ 40 張玻片并在40 倍下拍照記錄[24]。

1.2.3 雜交試驗

人工授粉試驗設置為3 組：水晶蜜柚× 水晶蜜柚（自交）；水晶蜜柚× 三紅蜜柚（雜交）；水晶蜜柚去雄套袋不授粉。選擇大小一致的200朵健康花進行試驗，父本為新鮮的花粉，于果實成熟期統計果實數量與果實種子數。

1.2.4 花粉管伸長熒光顯微觀察

授粉組合水晶蜜柚× 水晶蜜柚和水晶蜜柚×三紅蜜柚授粉后2、4、14、24、48、72、96 h、1 周采集雌蕊，用卡諾固定液固定12 h，然后轉入70% 乙醇，4 ℃保存備用。

取出樣品后小心轉移到裝有8 mol/L NaOH 溶液的培養皿中，軟化約12 h，然后用蒸餾水清洗3次，此時，樣品比較軟，近乎透明，在常溫避光條件下用0.1% 苯胺藍溶液（NaH2PO4-Na2HPO4·12H2O，pH=8）染色約4 h，然后把樣品放在載玻片上，用蓋玻片輕輕壓住封片，在熒光顯微鏡10 倍下觀察拍照，每個時間段重復3 次[22]。

1.2.5 雌配子體的育性觀察

取樣：采集水晶蜜柚不同大小的健康花（現蕾3、6、9、12 d，剛開花、謝花、幼果）。授粉組合水晶蜜柚自交、水晶蜜柚與三紅蜜柚雜交后24、48、72、96 h、2 周、3 周，分別采集子房或幼果。

固定：采集的樣品用卡諾固定液固定約12 h。倒去固定液轉入70% 乙醇中，4℃保存備用。

固定好的樣品采用常規石蠟切片法進行切片觀察[25]。

1.3 數據處理

所有數據均為3 次平行試驗的平均值，用SPSS 26.0 軟件對試驗數據進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2.1 水晶蜜柚和三紅蜜柚花粉的活力

水晶蜜柚和三紅蜜柚花粉的活力如表1 所示。可以看出，兩個品種柚子的花粉都有活力。花粉染色結果為藍黑色和黃褐色，藍黑色的花粉表現為活力強，黃褐色的花粉表現為活力弱。水晶蜜柚活力強的花粉占比比三紅蜜柚高，達到了顯著差異，相應的活力弱的花粉百分比較低，也達到了顯著差異。

2.2 水晶蜜柚和三紅蜜柚的花粉萌芽率

花粉萌發率分3 個時間段觀察（12、24、48 h）（表2），12 h 有少量的花粉萌發，48 h 時花粉基本萌發完畢，水晶蜜柚花粉的萌發率88.48%，而三紅蜜柚的萌發率只有51.69%，兩者達到了顯著差異。從兩個品種柚子的花粉活力和萌發率來看，兩者的花粉（雄配子）育性正常。

2.3 水晶蜜柚花粉母細胞減數分裂觀察

減數分裂是植物生殖細胞形成的重要環節。圖1 為水晶蜜柚花粉母細胞減數分裂各個時期的分裂相，水晶蜜柚花粉母細胞能正常經過兩次減數分裂，即前期Ⅰ（圖1A）、中期Ⅰ（圖1B）、后期Ⅰ（圖1C）、前期Ⅱ（圖1D）、中期Ⅱ（圖1E）、后期Ⅱ（圖1F）、四分體時期（圖1G）。細胞處于減數分裂末期Ⅰ時，細胞分裂形成1 個雙核細胞，染色質沒有解聚，這種細胞質不分裂的現象，被稱為胞質同時型。細胞處于減數分裂末期Ⅱ時，由1 個雙核細胞形成4 個染色體減半的細胞，花粉母細胞的減數分裂結束之后進入四分體時期，形成四核細胞，核之間產生胼胝質壁形成左右對稱、排列方式主要為四面體型的四分體孢子，沒有觀察到其他類型的四分體。在四分體時期觀察發現減數分裂過程中有部分二分體（圖1J）和三分體（圖1K）出現了異常現象，觀察統計303 個細胞，其中異常二分體的數量為10 個，比例為3.30%；異常三分體數量為41 個，比例為13.53%。之后進入單核期，在胼胝質酶的酶解下，幼期單核花粉粒從四分體中釋放出來，形成游離狀態的小孢子，細胞核處于細胞中央，細胞體積相對小。雙核期單核靠邊期的小孢子進行1 次有絲分裂形成2 個細胞核，體積大的為營養核，體積小的為生殖核。

2.3 雜交試驗

雜交試驗結果如表3 所示，不同的雜交組合果實坐果率和種子均存在差異。水晶蜜柚與三紅蜜柚雜交所得的果實比其自交和去雄套袋不授粉多，水晶蜜柚雜交坐果率達21%，而其自交和去雄套袋不授粉則只有3% 和2%。水晶蜜柚雜交所獲得的種子有3 種形態，其中平均每個果的飽滿種子數為156.6 個，退化種子數為14 個，敗育種子數為11.1 個；其自交和去雄套袋不授粉沒有飽滿的種子，自交的果實有少量的敗育種子，而去雄套袋不授粉的只有退化的種子。

2.4 花粉管伸長熒光顯微觀察

對水晶蜜柚自交和雜交（三紅蜜柚花粉作父本）的花粉管進行熒光顯微觀察，對比兩者之間花粉管的伸長情況。從熒光顯微觀察可看出，雜交授粉2 h 后有少量花粉開始萌芽，長出了花粉管（圖2A）；雜交48 h 后花粉管通過乳突細胞伸長至花柱中部（圖2B，圖2C），沿著花柱道向下生長；雜交授粉96 h 后，花粉管伸長至花柱基部（圖2D，圖2E），進一步向子房生長；授粉1 周后，逐漸有花粉管向子房生長（圖2F），在子房內部可觀察到花粉管。自交的花粉管伸長跟雜交明顯不同，自交授粉14 ～ 24 h 后，可觀察到大量花粉在柱頭萌發并通過乳突細胞伸長至花柱上部（圖2G，圖2F）；自交授粉48 h 后，少部分的花粉管伸長到了花柱中部（圖2I）；到自交授粉后72 h時還可觀察到極少數花粉管的生長（圖2J），伸長至花柱中下部；自交授粉96 h 后，在花柱基部已經觀察不到花粉管的生長（圖2K），說明花粉管伸長不到花柱基部，自交授粉1 周后在子房也沒有觀察到花粉管（圖2L）。

花粉管伸長熒光顯微觀察說明水晶蜜柚雜交花粉管能伸長至子房到達胚珠，完成受精，而自交的花粉管無法到達子房，不能完成受精。因此，初步推測水晶蜜柚自交不親和。

2.5 雌配子體的育性觀察

選取水晶蜜柚從現蕾期到幼果期的子房進行石蠟切片觀察其胚囊發育情況，再選取水晶蜜柚自交和雜交后的子房進行石蠟切片對比觀察其胚胎發育情況。從切片的觀察結果得知，從現蕾期到開花期，水晶蜜柚的胚囊生長正常，此時能從幼胚（圖3A）觀察到球形胚（圖3B）的形成。到幼果期時，可觀察到胚囊由心形胚（圖3C）向魚雷形胚（圖3D）發育。進入了分化時期，心形胚是左右兩邊對稱、頂端扁平的結構，因類似心形故稱心形胚，它是由球形胚發育形成的，心形胚進一步發育成魚雷形胚，因其頂端扁平結構進化發育成兩枚微微突起的子葉，形狀類似魚雷；魚雷形胚最終發育成子葉胚。但在幼果期沒有觀察到魚雷形胚發育成子葉胚，而是在魚雷胚的時候胚囊開始出現中空狀態（圖3D），珠柄消失，極核降解，珠被退化。

水晶蜜柚自交和雜交的子房切片從授粉后24 h、48 h、72 h、96 h、2 周和3 周6 個時間段進行觀察，從切片觀察結果可看出，水晶蜜柚雜交授粉胚囊的發育歷程為：幼胚（圖3K）→球形胚（圖3L）→心形胚（圖3M）→魚蕾形胚（圖3N）→子葉形胚（圖3O）。子葉胚繼續正常發育，有發展成種子的跡象，其大部分珠柄還存在。水晶蜜柚自交授粉后24 ～ 96 h 期間，同雜交授粉觀察結果一樣，觀察到幼胚（圖3F）和球形胚（圖3G），自交授粉2 周后出現了心形胚（圖3H）、魚雷形胚（圖3I），魚雷胚發育到3 周時大部分胚囊出現了中空現象（圖3J），珠被逐漸退化，珠柄消失，胚珠逐漸瓦解。結果表明，水晶蜜柚不做處理時與其自交的胚胎發育一致，前期發育均正常，后期有大部分胚囊出現中空狀態。雜交的胚胎前期也正常發育，后期少量胚囊中空，大部分胚囊正常，沒有出現胚胎中途敗育或異常現象，與人工授粉實驗收獲的果實種子形態一致。說明水晶蜜柚的胚囊是可育的。

3 結論與討論

3.1 結 論

水晶蜜柚花粉育性正常，沒有雄性不育和雌性不育的特性；水晶蜜柚異花授粉時花柱能在柱頭正常萌發，花粉管伸長至花柱和子房；自花授粉時花粉能在柱頭上萌發，但在花柱中停止伸長，在子房沒有觀察到花粉管。表明水晶蜜柚自交不親和，其無籽是由自交不親和導致的。

3.2 討 論

I2-KI 法染色原理是有生活力的花粉里積累的淀粉遇碘后變藍，所以判定的方法是染色后變藍的花粉是有生活力的。這與實際測定的結果有偏差，因為，淀粉積累的含量與花粉敗育階段有關，花粉敗育早期積累的淀粉少或者沒有積累，染色時則會呈現無色或淺色，花粉敗育晚期，淀粉積累的含量會隨著時間延長而增加，這時染色會變深，而這些花粉是沒有活力的，另外，花粉失去了活力，而淀粉沒有被水解，這時花粉也會顯色[26-27]。在本研究中，花粉經I2-KI 染色后，觀察到的水晶蜜柚花粉有大部分呈藍黑色，少部分呈黃褐色，而三紅蜜柚花粉則相反，大部分花粉呈黃褐色，少部分花粉呈藍黑色。染成藍黑色的花粉粒說明淀粉含量高，染成黃褐色的花粉粒說明淀粉含量低。

離體培養法判斷花粉是否有活力的依據是花粉萌發并長出花粉管，相比較染色法更準確直觀地反映花粉活力情況，與花粉真實的生活力較接近。不過離體培養法所需時間長，操作上對花粉量有要求，固體培養基上涂花粉時不能過多也不能過少，涂的密度大萌芽率高，涂的密度低萌芽率低，因為花粉萌發有“群體效應”。涂的時候盡量不讓花粉重疊，薄薄的一層，讓每個花粉保持一定的距離最佳[26]。

水晶蜜柚花粉母細胞減數分裂進程與花蕾大小有關，柚類一般花蕾直徑為5.00 mm 時是減數分裂觀察的好時期，可以觀察到減數分裂的各個時期[28]。水晶蜜柚各個時期的減數分裂是正常的，是完整的減數分裂過程，第一次核分類沒有出現細胞質分裂，只形成雙核細胞，胞質分類在第二次減數分裂結束時才發生，此時形成四個子細胞（四分體），因此，水晶蜜柚減數分裂中細胞質分裂是同時型和大多數雙子葉植物減數分裂一致[29]。此外，本研究發現水晶蜜柚減數分裂有出現二分體、三分體異常現象，陳欣等[30] 認為胡楊減數分裂中出現三分體和二分體，可能原因是減數分裂過程中紡錘體與胞質分裂異常；劉麗琴等[31] 則認為荔枝減數分裂產生的多分體是因為小孢子分生體含有異常的染色體隨機分布于細胞質中，細胞質不均等分裂導致的。

胚胎胚囊敗育也是引起柑橘果實無籽的原因之一。植物一般要經過授粉完成受精后，受精卵才能正常發育形成飽滿種子，如果受精卵在形成后細胞結構發生異常，如胚胎在胚囊外發育或內珠被細胞敗育等，則導致胚收縮并解體，最后產生空癟種子。胚胎發育是復雜且有序的，是細胞不斷變化的過程，其中任何環節出問題都會影響胚胎發育[32-34]。水晶蜜柚雌配子體發育過程的結果表明水晶蜜柚胚囊發育正常，水晶蜜柚與三紅蜜柚雜交后胚胎正常發育并形成有種子的果實。水晶蜜柚自交后胚胎發育到后期出現中空，珠柄消失，胚珠逐漸退化。在去雄不授粉后也能形成無籽果實，但坐果率比授粉條件低。

SI 是植物界廣泛存在的一種生殖現象，也是導致果實無籽的原因之一。本試驗通過熒光顯微觀察水晶蜜柚花粉的發育發現，自交和雜交花粉均能在柱頭上黏附、萌發并通過柱頭乳突細胞伸長至出花粉管，雜交授粉后2 h 時就可觀察到花粉萌發，而自交授粉后14 h 才觀察到花粉管伸長。雜交授粉后的花粉管能伸長至子房，完成受精。而自交授粉后的花粉管只能伸長至花柱中部，花粉管不能到達子房完成受精。此外，在相同的環境下，不同授粉組合的花粉萌發和花粉管生長速度可鑒定其親和性強弱[35]。

SI 是開花植物為防止近親繁殖和促進異交而采取的一種繁殖策略，這是一種促進遺傳多樣性的繁殖方式[36]。廣義上，SI 可分為同態和異態兩種類型，在異態型SI 中，自交不親和植株產生兩種不同類型的花：短花柱和長花柱，長或短的心皮分別與短或長的雄蕊配對[37]。在同態型SI 中，來自同一物種的花具有相同的形態。同態型SI 又可分為兩種類型：配子體自交不親和（gametophyticself-incompatibility，GSI） 和孢子體自交不親（sporophytic self-incompatibility，SSI）。這取決于參與不親和反應的花粉粒的基因組[38]。在GSI 中，SI 是基于花粉的單倍體基因型（即配子體），在SSI 中，它是基于親本（即孢子體）的二倍體基因[39]。SSI 的抑制發生在柱頭上。而GSI 的抑制在花柱中[40]。本研究中，水晶蜜柚自交不親和表現為花粉可以黏附在柱頭上萌發，花粉管通過乳突細胞伸長至花柱中部，然后停止生長，這種不親和的特征表現為配子體自交不親和（GSI）類型。

坐果率是反應親和性強弱的重要指標，本研究中水晶蜜柚3 個授粉組合坐果率的結果顯示，水晶蜜柚自交和去雄套袋不授粉兩個組合的坐果率很低，只有2% 和4%，而雜交組合的坐果率為21%，與花粉管熒光顯微觀察的結果大致符合。

本研究從細胞學水平闡明了水晶蜜柚果實無籽的原因是其自交不親和，但關于水晶蜜柚自交不親和的分子調控機制尚未明確。學者們對柑桔自交不親和的分子調控機制研究取得了很大進展，挖掘出許多候選基因。因此，未來可深入研究水晶蜜柚自交不親和的分子調控機制，挖掘出相關的調控基因。

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[ 本文編校：趙 坤]