‘貴妃’杧果胚敗育果實植物激素生物合成的轉錄組分析

摘 要：【目的】為創制胚敗育特異種質和優質胚敗育杧果生產提供參考。【方法】以花后第14、16、18、20周4 個發育時期的‘貴妃’杧果的胚正常果和胚敗育果作為研究對象，基于轉錄組測序數據，探討胚正常和胚敗育杧果中乙烯、生長素、赤霉素、脫落酸、油菜素甾醇和茉莉酸6 種植物激素生物合成途徑中差異表達基因的表達趨勢，研究其在胚正常和胚敗育杧果中的作用和差異。選取15 個具有指示和標記作用的關鍵差異表達基因進行熒光實時定量PCR，對轉錄組測序和分析結果的可靠性進行驗證。【結果】‘貴妃’杧果胚正常和胚敗育果實中參與植物激素生物合成途徑的關鍵基因表達情況在不同發育階段存在明顯差異，且呈現一定規律。胚敗育果中調控乙烯合成的關鍵基因在花后第14、16 周的表達量高于胚正常果，而調控生長素合成的關鍵基因表達量低于胚正常果；調控茉莉酸合成的關鍵基因大多在胚敗育果中表達量更高。熒光實時定量PCR 的結果與轉錄組分析結果基本一致，表明結果真實可靠。【結論】乙烯、生長素和脫落酸共同調控了‘貴妃’杧果胚敗育果的早熟，赤霉素調控了胚正常果果形更大，杧果在受到外界環境脅迫的時候，更容易產生胚敗育果。

關鍵詞：杧果；胚敗育；植物激素；轉錄組；發育時期

中圖分類號：S667.7 文獻標志碼：A 文章編號：1003—8981（2023）04—0068—11

杧果Mangifera indica 主要分布于東南亞熱帶和亞熱帶地區[1]，是一種高大常綠喬木果樹，其果實風味獨特、營養豐富，富含糖、纖維素和多種維生素[2]。因其栽培范圍廣、果實營養價值高且外觀漂亮，深受人們喜愛[3]。其果實作為一種重要的熱帶和亞熱帶水果，被稱為“熱帶水果之王”[4]，是繼葡萄、柑橙、香蕉、蘋果之后的世界第五大水果[5-6]。

胚敗育是指由于自身或其他外界因素，種子植物受精胚的發育過程中途停止，導致胚退化消失或僅留下部分硬化的種痕[7]。胚敗育存在于許多植物中，如葡萄、荔枝、龍眼、枇杷、櫻桃、棗、柿、黃皮、柑橘等[8]。因果實胚敗育后不能形成種子，對許多果樹來說，會形成“無核果實”這一良好的栽培性狀，但另一方面，胚敗育嚴重制約了雜交育種。因此，調控胚的發育具有重要意義[9]。

胚敗育現象在杧果生產中普遍存在[10]，在部分品種中表現尤其突出。‘貴妃’杧果是海南和云南杧果種植區的主栽品種，在云南被稱為“金鳳凰”，其在正常的氣候和栽培條件下會產生一定比例的成熟胚敗育果實，在特定的年份甚至整棵樹乃至整片果園出現胚敗育的現象。盡管‘貴妃’杧果敗育果實比正常果實小，但是由于其成熟期早，且具有色澤艷麗、果核極薄、含糖量高、風味濃郁等獨特的品質優勢，在云南省元江干熱河谷等杧果主產區的銷售價格明顯高于胚正常果實。果實品質已成為當前及未來經濟林果樹產業健康發展和市場競爭力的核心[11]，所以敗育果具有較大的商業前景。

植物的生長發育依賴于植物激素介導的基因表達調控，植物激素在胚發育過程中起著至關重要的作用。例如：生長素（IAA）、細胞分裂素（CTK）、赤霉素（GA）和油菜素甾醇（BR）通常促進植物的生長，并顯著影響植物的株高和器官大小，乙烯（ET）、脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）和茉莉酸（JA）調控植物的脅迫響應和延緩植物的生長[12]；IAA、GA 和BR 在胚發育過程中起正向調控作用，ABA 和JA 起負向調控作用[13-14]。

RNA 測序（RNA-Seq）是一種將讀長較短的序列組裝成基因組規模轉錄譜的轉錄組分析技術，為轉錄組組成和RNA 表達模式分析及基因鑒定提供了一種全面而有效的方法[15]。近幾年來，由于測序成本的持續降低，轉錄組測序技術在農作物研究方面的應用越來越廣泛[16]。胚敗育為‘貴妃’杧果生產中的重要現象，直接影響著果實的價值和果園收益，但針對‘貴妃’杧果胚敗育現象的轉錄組研究鮮見報道。

本研究中利用轉錄組測序技術，以‘貴妃’杧果花后第14、16、18 和20 周的正常果和敗育果為材料，篩選ET、IAA、GA、ABA、BR、JA這6 種植物激素的生物合成途徑中的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）， 分析其在不同發育時期的正常果和敗育果中的表達差異，以期揭示杧果胚敗育果實中激素生物合成的分子機制，為胚敗育特異種質創制和高品質胚敗育果栽培提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以‘貴妃’杧果的正常果和敗育果為試驗材料。樣品采自2016 年在大塑料桶中種植的試驗樹，栽培管理條件相同。2021 年1 月，選擇生長發育良好、樹勢一致、花期一致的30 株杧果樹，對每個花序進行掛牌標記，并于花后第14、16、18、20周4 個時期定期采樣。同一株樹上，既有正常果，又有敗育果。每次采樣時，在每株樹上隨機采集正常果和敗育果各5 ～ 10 個，迅速切取果肉進行液氮預冷，每10 棵樹做1 個混樣，每個時期的正常果和敗育果均采集3 個混樣，即3 次生物學重復。將樣品貯存于-80 ℃超低溫冰箱中待用。

1.2 試驗方法

1.2.1 轉錄組測序

分別從各時期正常果和敗育果的果肉中提取總RNA，參考趙鳳霞等[17] 的方法，構建cDNA文庫，片段長度為150 bp。經文庫質檢合格后，使用Illumina HiSeq 平臺進行雙端測序。對下機后的原始測序數據進行過濾、測序錯誤率檢查、GC 含量分布檢查，獲得用于后續分析使用的clean reads。使用Trinity 軟件對clean reads 進行拼接，將拼接得到的轉錄本序列作為參考序列，以Corset 層次聚類后得到的最長Cluster 序列作為Unigene 進行后續分析。采用RSEM 軟件中的bowtie2，將每個樣品的clean reads 與參考序列比對，采用FPKM（fragments per kilobase of transcript per millionfragments mapped）值計算基因的表達水平。正常果和敗育果樣品間的差異表達基因篩選條件為差異倍數的絕對值不小于1，且錯誤發現率小于0.05。

1.2.2 KEGG 注釋

使用BLAST 2.7.1 軟件將差異表達基因序列與KEGG 數據庫進行比對（e=1×10-5），獲得差異表達基因的KEGG 注釋信息。6 種植物激素生物合成路徑來自于KEGG 在線數據庫（http：//www.genome.jp/kegg/），包括半胱氨酸和甲硫氨酸代謝通路（ET 生物合成路徑，通路ID 00270），色氨酸代謝通路（IAA 生物合成路徑，通路ID00380），二萜生物合成通路（GA 生物合成路徑，通路ID 00904），類胡蘿卜素生物合成通路（ABA生物合成路徑，通路ID 00906），油菜素甾醇生物合成通路（BR 生物合成路徑，通路ID 00905）和α- 亞麻酸代謝通路（JA 生物合成路徑，通路ID 00592）。使用RStudio 軟件繪制差異表達基因的熱圖。

1.2.3 反轉錄熒光實時定量PCR（qRT-PCR）驗證

以所篩選激素合成路徑中的差異表達基因為樣本，進一步篩選出15 個具有指示和標記作用的關鍵差異表達基因，采用Actin 作為內參基因，使用beacon Designer 軟件設計引物， 進行qRTPCR表達量驗證。使用與轉錄組測序相同處理的樣本提取高質量RNA，采用20 μL 反應體系，反轉錄反應條件為65 ℃ 5 min，37 ℃ 2 min，55 ℃15 min，85 ℃ 5 min。迅速將獲得的cDNA 置于冰上，用于后續試驗，或立即保存（-20 ℃）。qRT-PCR 所采用的設備為7500 型熒光定量PCR儀（ABI，美國），反應體系10 μL，反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 個循環。然后繪制溶解曲線，采用 2-ΔΔCt 法計算基因的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 敗育果和正常果的表型差異

同一株‘貴妃’杧果樹上，既有正常果也有敗育果，且敗育果的成熟期比正常果早1 ～ 2 周。在果實發育早期，同一發育時期的敗育果果皮著色比正常果更濃，色澤更艷麗，正常果的生長速度和成熟果實大小均明顯大于敗育果（圖1）；到花后第14 周，正常果與敗育果的果實大小已經有明顯區別（圖1A）。

將不同發育時期的‘貴妃’杧果果實沿腹縫線方向剖開，可以發現正常果的種子較厚，種仁飽滿且發育正常，而敗育果的種子極薄，其種仁在果實發育早期即開始退化，花后第14 周的種仁已退化成為直徑小于1 mm 的白色點狀組織（圖1B），在成熟果中種仁退化后僅保留了直徑小于1 mm 的黑色點狀組織（圖1H）。

2.2 敗育果和正常果激素合成路徑中的差異基因

用于qRT-PCR 的15 個基因分別是：乙烯信號途徑的metK 基因、ACS1_2_6 基因和ACO 基因；生長素信號途徑的ALDH 基因和E3.5.1.4 基因；赤霉素信號途徑的GA3 基因和KAO 基因；脫落酸信號途徑的ZEP 基因、NCED 基因和CYP707A基因；油菜素甾醇信號途徑的CYP85A1 基因和CYP92A6 基因；茉莉酸信號途徑的ACX 基因、MFP2 基因和ACAA1 基因。15 個基因的qRT-PCR產物為100 ～ 192 bp。

2.2.1 ET 生物合成路徑

ET 是一種被人們熟知且被廣泛應用于農業生產的小分子氣體植物激素。ET 是以甲硫氨酸為合成前體， 在metK、ACC 合成酶（ACS）、ACC氧化酶（ACO）的催化作用下，逐步合成ET。由于植物中甲硫氨酸的含量有限，甲硫基被循環利用來補充甲硫氨酸和維持ET 的生物合成[18]。從RNA-seq 數據中獲得了12 個參與ET 生物合成路徑的差異基因，分別屬于metK、ACS1_2_6、ACO、speD、DEP1、TAT 和ISS1 基因家族（圖2）。在花后第14、16 周時，ACO 基因作為ET 合成的限速酶，在敗育果中的表達量更高，而在花后第18 周時，在正常果中的含量更高。

2.2.2 IAA 生物合成路徑

植物通過3 種途徑將色氨酸轉化為IAA，分別是吲哚-3- 丙酮酸途徑、色胺途徑和吲哚-3- 乙腈途徑[19]。其中，吲哚-3- 丙酮酸途徑是首個被完全闡明的IAA 生物合成途徑，也是植物IAA 合成途徑中最基本、最重要的途徑[20]。從RNA-seq 數據中篩選獲得了11 個參與IAA 生物合成路徑的差異基因，分別屬于YUCCA、TAA1、DDC、ALDH和E3.5.1.4 基因家族（圖3）。YUCCA 基因是吲哚-3- 丙酮酸途徑的限速酶，其表達模式在IAA合成中起著至關重要的作用[21]。YUCCA 基因主要在花后第14、16 周表達，且在正常果中的表達量更高。除ALDH 基因外，其他基因的表達模式均與YUCCA 基因一致。

2.2.3 GA 生物合成路徑

GA 是雙胍類化合物中的一類植物激素，在植物的整個生活史中起著至關重要的作用。因能促進漿果體積及其簇長的生長，GA 被廣泛應用于無核葡萄生產[22-23]。由異戊烯基焦磷酸酯合成的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl-PP）是高等植物GA 生物合成的前體[19]。從RNA-seq 數據中篩選出6 個參與GA 生物合成路徑的差異基因，分別屬于GA3、KAO、GA20ox、GA3ox 和GA2ox基因家族（圖4）。其中，GA3 和KAO 參與GA的合成，GA3ox、GA20ox 和GA2ox 參與GA 之間的轉化。與敗育果相比，GA3 和KAO 這2 個參與GA 合成的關鍵基因均為在正常果中的表達量更高，可能與正常果果形更大有關。

2.2.4 ABA 生物合成路徑

ABA 是抑制種子萌發的主要內源激素[24]。ABA 生物合成基因ZEP 和NCED 可提高種子中ABA 的水平[25]，而ABA 分解代謝基因CYP707A基因家族降低了ABA 的水平[26]。ABA 合成和降解的動態平衡決定了其穩態的維持。通過RNAseq數據分析，篩選了參與ABA 生物合成路徑的11 個差異表達基因，分別屬于9 個基因家族（圖5）。不同的基因家族在不同發育階段有不同的表達模式，其中：ABA 生物合成關鍵基因ZEP 在敗育果中表達量高；ABA 生物合成關鍵基因NCED在花后第14 周的敗育果中表達量高，在花后第16周的正常果中表達量高，在其他2 個時期表達量均較低；ABA 代謝關鍵基因CYP707A 的表達模式類似于NCED。與其他激素相比，ABA 合成代謝相關基因的表達模式是復雜的。

2.2.5 BR 生物合成路徑

BR 是一類含有多羥基的甾醇類化合物的總稱，其中油菜素內酯（brassinolide，BL）是一種活性最高的BR。BR 的生物合成路徑主要有2 條（圖6）：一條是依賴于油菜甾烷醇途徑，油菜甾醇經過催化形成油菜甾烷醇，再通過早期的C6氧化途徑或者晚期的C6 氧化途徑轉化為BL 的合成前體BR[27-28]；還有一條不依賴于油菜甾烷醇途徑，也是BR 合成的主要途徑，由油菜甾醇經過8 步催化，合成BL[29]。通過對RNA-seq 數據中參與BR 生物合成路徑的關鍵基因的表達量分析， 獲得了屬于CYP724、CYP90D1、CYP92A6和CYP85A1 基因家族的6 個差異基因。BR 合成的2 條路徑合成1 個共同的中間產物6- 脫氧油菜素甾醇，以此為底物合成BR，均需要CYP92A6和CYP85A1 的調控。CYP92A6 主要在花后第14—18 周表達，且在敗育果中的表達量更高；CYP85A1 正好相反，主要在花后第20 周表達，且在正常果中的表達量更高。

2.2.6 JA 生物合成路徑

JA 是植物體內一類重要的脂質激素，介導植物對生物脅迫和非生物脅迫的防御反應，其生物合成經歷了依次發生在葉綠體、過氧化物酶體、細胞質中的多步催化過程[30]。通過對不同發育階段正常果和敗育果的RNA-seq 數據進行分析，獲得了參與JA 生物合成路徑的16 個關鍵基因，分別屬于DAD1、LOX2S、AOS、AOC、OPR、OPCL1、ACX、MFP2 和ACAA1 基因家族（圖7），這些基因大多在敗育果中的表達量更高。

2.3 qRT-PCR 驗證

為了進一步驗證轉錄組測序和分析結果的可靠性，以在轉錄組測序中使用的花后第14、16、18、20 周的‘貴妃’杧果正常果和敗育果的同一批果肉為材料提取RNA 后，使用qRT-PCR 對15 個差異表達基因進行表達量驗證，結果如圖8所示。由圖8 可知，在這4 個發育時期，15 個差異表達基因在‘貴妃’杧果敗育果和正常果中均表現出不同程度的表達變化。15 個基因的qRTPCR分析結果與轉錄組分析結果基本一致，表明結果真實可靠。

3 結論與討論

本研究中利用轉錄組測序技術，分析了4 個發育時期‘貴妃’杧果胚敗育果和胚正常果中，調控6 種植物激素生物合成的關鍵基因的表達模式，結果表明ET、IAA 和ABA 共同調控了‘貴妃’杧果胚敗育果的早熟，GA 調控了胚正常果果形更大，杧果在受到外界環境脅迫的時候，更容易產生胚敗育果。

早期的杧果胚敗育研究主要集中在生理機制和栽培技術方面，與激素相關的研究主要聚焦在外源激素處理對杧果果實發育、果實品質的影響等方面。近年來，隨著轉錄組技術的發展和成本的降低，轉錄組測序技術在杧果研究中的應用逐漸增多，但對關鍵成分生物合成及代謝機制的研究報道較為鮮見。

本研究結果表明，合成ET 的關鍵基因在花后第14、16 周時在敗育果中的表達量更高，而在花后第18 周時在正常果中的表達量更高。ET 作為一種多功能的植物激素，其主要功能之一就是促進果實成熟。對于杧果這類呼吸躍變型水果而言，果實中ET 含量升高，則果實成熟會被啟動。ACS和ACO 基因在植物果實發育過程中通過催化ET的合成來促進果實成熟。本研究結果表明，ACO基因在胚敗育杧果中的表達量高峰比胚正常果早2 周左右，同一株‘貴妃’杧果樹上的敗育果比正常果提前1 ～ 2 周成熟，這證實ACO 基因的高表達主導了胚敗育‘貴妃’杧果早熟性狀的形成。

許多植物的內源IAA 合成水平隨著果實的生長發育逐漸降低[31-32]。本研究結果表明，調控‘貴妃’杧果IAA 合成的大部分基因是在果實發育前期表達，說明杧果果實發育過程中IAA 的合成與其他植物存在著一致性規律。在IAA 合成途徑中，將色氨酸轉化為IAA 有3 條途徑，根據調節杧果果實中IAA 合成不同途徑關鍵基因的表達模式，可以推測在‘貴妃’杧果中，前期主要通過吲哚-3- 丙酮酸途徑和色胺途徑合成IAA，后期主要通過吲哚-3- 乙腈途徑合成IAA。此外，杧果果實的IAA 合成途徑中除ALDH 基因以外，YUCCA、TAA1、DDC 和E3.5.1.4 共4 個基因家族的11 個IAA 合成相關基因在敗育果中的表達量均低于正常果。IAA 是促進果實體積增長的重要激素，正常果中的IAA 合成基因表達量高于敗育果，說明其IAA 合成比敗育果旺盛，這可能是正常果體積遠大于胚敗育果的主要原因。此外，周麗萍等[33]認為IAA 水平的下降可導致細胞對ET 更為敏感，這可能是敗育果比正常果成熟早的另一個原因。

ABA 和GA 在生物合成中共享甲羥戊酸途徑的早期部分[34-35]。在本研究中，調控ABA 合成前期的基因大多在胚敗育果中表達量高，調控GA 合成的基因大多在胚正常果中表達量高，據此推測，ABA 和GA 合成的共同底物牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸在胚敗育果中主要參與ABA 的合成，在胚正常果中主要參與GA 的合成。Wu 等[36] 經研究發現，在凱特杧果果實中ABA 信號可以直接誘導一些響應因子的表達，導致杧果果實成熟相關基因的上調。結合本研究結果推測，ABA 在胚敗育果中的含量可能高于胚正常果，這可能是敗育果成熟早的原因之一。但是因為參與ABA 合成后期的基因和參與ABA 代謝的基因在不同發育時期的表達模式不一致，所以這一結論還有待驗證。

GA 的合成水平與果實大小相關，在杧果生產中，為了促進果實膨大，果農也會廣泛使用噴施外源GA 的方法[37]。本研究結果表明，在‘貴妃’杧果果實GA 合成途徑中，參與GA 合成的關鍵基因GA3 和KAO 均為在正常果中的表達量更高，這可能是正常果比敗育果體積更大的另一個原因。

主導BR 生物合成的CYP724、CYP90D1、CYP92A6 和CYP85A1 共4 基因家族的6 個關鍵基因在不同時期的胚敗育果和正常果中的表達不存在一致性規律，說明杧果胚敗育果的發育成熟與BR 無明確關系。

JA 主要是作為抗性激素在植物抗逆的生物過程中起重要作用。本研究結果表明，調控JA 合成的DAD1、LOX2S、AOS、AOC、OPR、OPCL1、ACX、MFP2 和ACAA1 共9 個基因家族的16 個關鍵基因大多在敗育果中表達量更高，其原因可能有2 種：一是胚敗育現象的出現與植物受到環境的脅迫有關，在受到脅迫的環境下更容易出現胚敗育現象，這也與Shaban 等[38] 的研究結果一致；二是敗育果的發育存在缺陷對于植物本身而言就屬于一種脅迫，更容易誘導JA 合成關鍵基因的高表達。

從研究結果可以看出，不同植物激素合成代謝相關基因在不同發育階段的‘貴妃’杧果正常果和敗育果中的表達模式較為復雜，尤其是ABA和BR 合成代謝相關基因幾乎不存在一致性的規律，這可能與本研究中樣品采集時期較少有關。下一步將從坐果初期開始定期采樣，直至果實成熟，利用更多發育時期的轉錄組數據對‘貴妃’杧果胚敗育果發育過程中的植物激素合成代謝相關基因的表達模式開展進一步研究。因為植物激素調控的生物過程多且復雜，既有獨立作用，也有協同調控，所以僅采用轉錄組分析不能完全闡明植物激素在胚敗育果和胚正常果中的作用，今后還應進行靶向代謝組分析，并進行相關驗證。

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[ 本文編校：聞 麗]