玫瑰茄水提物抗氧化及抑菌活性研究

歐小勇，潘文章，楊通蓮，歐工華

（貴州省從江縣動物疫病預防控制中心，貴州 從江 557400）

2020 年，中華人民共和國農業農村部公告第194 號文件指出，為維護我國動物源性食品安全和公共衛生安全，決定停止生產、進口、經營、使用部分藥物飼料添加劑。隨著該公告的頒布，多種促生長的藥物添加劑及抗生素不得在飼料中使用。因此，尋找富含生物活性物質、毒副作用小且殘留性低的植物提取物添加劑迫在眉睫[1-2]。玫瑰茄（Hibiscus sabdariffaL.）屬錦葵科木槿屬藥食同源類植物，其花萼色彩鮮艷、色質好，富含有機酸、花色苷、多酚、多糖及黃酮等活性成分，具有抗氧化、抗癌及降血糖等功效[3-5]，廣泛用于食品、化妝品等領域[6]。除此之外，近年來國內外研究還發現，玫瑰茄還具有防治心血管疾病和殺菌驅蟲等功效[4-5]。目前，國內對玫瑰茄的研究集中在其醇提花色苷的抗氧化和抗腫瘤作用等方面。劉小琳等[5]發現，玫瑰茄醇提花色苷具有較強的抗氧化能力，清除羥自由基的IC50值為169.1 μg/mL，優于VC 的448.5 μg/mL。Malacrida 等[7]和Lin 等[8]研究表明，玫瑰茄花色苷對乳腺癌和胃癌腫瘤細胞的生長均有顯著的抑制作用。而關于玫瑰茄水提物的抗氧化及抑菌活性鮮有報到。基于此，筆者以玫瑰茄水提物為研究對象，探索玫瑰茄作為飼用抗氧化劑及抑菌防腐劑時的綜合利用效果。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的玫瑰茄購買于云南省武定縣，生產標準號為Q/LAKX0009S，其他試劑還有1,1–二苯基–2–三硝基苯肼（DPPH，梯希愛上海化成工業發展有限公司），FRAP、ABTS 總抗氧化能力檢測試劑盒（碧云天生物技術研究所），抗壞血酸（VC，阿拉丁公司），鹽酸金霉素（中國食品藥品檢定研究院），胰蛋白胨、酵母粉、氯化鈉等（國藥集團化學試劑有限公司）。供試的枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及腸炎沙門氏菌均購自中國典型培養物保藏中心。主要儀器設備有全波段酶標儀（帝肯InfiniteM 200PRO 型）、紫外可見分光光度計（上海舜宇恒平UV 2400 型）。

1.2 玫瑰茄水提物（HWE）的制備

將玫瑰茄花萼置于粉碎機中粉碎，以料液比1 ∶25 的配比將玫瑰茄花萼粉末加入蒸餾水中進行超聲提取，提取液真空抽濾后旋轉蒸發至黏稠狀，移入低溫真空冷凍干燥箱，干燥后碾壓成粉末狀，裝入密封袋于－20℃冰箱保存備用。

1.3 DPPH 自由基清除能力測定

參考楊麗華等[9]的方法，準確配制1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 和0.1 mg/mL 的HWE 乙 醇 溶 液 及2.0×10-4mol/L 的DPPH 乙醇溶液。吸取DPPH 乙醇溶液3 mL，加入無水乙醇3 mL，標記為A0；分別取不同濃度的HWE 乙醇溶液3 mL，加入DPPH 溶液3 mL，標記為A1；分別取不同濃度的HWE 乙醇溶液3 mL，加入無水乙醇3 mL，標記為A2；所有溶液避光反應30 min，采用紫外可見分光光度計測定517 nm 波長處的吸光度值，每個樣品平行測定3 次取其平均值，以VC 為對照。用公式（1）計算HWE 的DPPH 自由基清除率（Y）。

1.4 FRAP 及ABTS 總抗氧化能力測定

準確配制1、2、4、6、8 和10 mg/mL 的HWE乙醇溶液。采用FRAP 及ABTS 總抗氧化能力檢測試劑盒測定HWE 乙醇溶液的FRAP 及ABTS 總抗氧化能力，具體操作參照說明書及文獻[10-12]的方法進行。圖1 為FRAP 及ABTS 總抗氧化能力測定標準曲線，標準曲線在一定濃度范圍內線性關系均表現良好。

圖1 FRAP（左）及ABTS（右）總抗氧化能力測定標準曲線

1.5 抑菌活性測定

1.5.1 LB 液體培養基及固體培養基的配制 參考羅飛亞[13]的方法配制LB 液體培養基和LB 固體培養基。LB 液體培養基中各成分比例為酵母粉（g）∶胰蛋白胨（g）∶氯化鈉（g）∶無菌水（mL）＝1 ∶2 ∶2 ∶200，LB 固體培養基中各成分比例為酵母粉（g）∶胰蛋白胨（g）∶氯化鈉（g）∶瓊脂粉（g）∶無菌水（mL）＝1 ∶2 ∶2 ∶3 ∶250，培養基配好后用封口膜密封，于立體式高壓蒸汽滅菌鍋121℃滅菌20 min，待冷卻到室溫后，放于4℃冰箱備用。

1.5.2 菌種的復蘇與純化 參照菌種使用說明書及何濤[14]的方法，在超凈工作臺里取出新購菌種，分別接種到裝有適量LB 液體培養基的離心管中，置于臺式恒溫振蕩器中37℃培養12 h；然后在超凈工作臺中將培養液接種到固體培養基上進行純化，一般至少傳3 代后再用接種環挑取單菌落于液體培養基中振蕩培養12 h 待用；純化后的菌液用之后60%甘油制成甘油菌，具體比例為0.8 mL 菌液+0.4 mL60%甘油，置于－80℃冰箱冷藏保存。

1.5.3 紙片抑菌法活性評價 參照文獻[15-16]的方法，將HWE 用20%DMSO 水溶液溶解并過0.22 μm 濾膜，然后將HWE 濃度依次稀釋成200、100、50 和25 mg/mL，以相同溶劑配制10 mg/mL 的鹽酸金霉素溶液作為陽性對照，以無菌水作為陰性對照，在配制好的藥液中加入無菌紙片（d=6 mm）浸泡12 h。吸取200 μL 菌懸液（濃度為1×105～2×105CFU/mL）于培養基的表面，用無菌涂布棒均勻涂布；將已浸泡過藥劑并瀝干的無菌濾紙片用無菌鑷子夾取貼在固體平板上，每個培養皿貼6 片，置于37℃恒溫培養箱中下培養24 h，采用十字交叉法[17]測定抑菌圈大小，取3 組平均值。

1.5.4 MIC 與MBC 評價 參照文獻[18-19]中的二倍稀釋法，用20%DMSO 水溶液將HWE 配制成100 mg/mL 的藥液，過0.22 μm 濾膜，用LB 液體培養基稀釋至50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 和0.78 mg/mL，將各濃度藥液取100 μL 依次加入96 孔細菌培養板的前8 個孔中，然后每孔均加入100 μL 已經稀釋好的菌液，第9 孔加100 μL 培養基和100 μL菌液，第10 孔加200 μL 培養基，設3 個重復。將孔板混勻蓋好，放37℃恒溫培養箱培養，24 h 后觀察孔內無彌散狀渾濁或孔底無沉淀的最低藥物濃度即為該測試菌株對HWE 的MIC。取無菌生長孔的液體培養物100 μL 涂布于LB 瓊脂平板上，37℃培養24 h，以無菌落生長的最低藥物濃度為MBC。同時設立以母液為10 mg/mL 的鹽酸金霉素作為陽性藥物代替HWE 按照上述步驟同步測定。

2 結果與分析

2.1 HWE 的抗氧化活性

2.1.1 DPPH 自由基清除能力測定 由圖2 可知，當2 種溶液濃度為0.1～0.6 mg/mL 時，VC 的DPPH自由基清除率大于HWE，當樣品溶液濃度大于0.6 mg/mL 時，HWE 的DPPH 自由基清除率明顯高于VC，當HWE 的濃度達到0.8 mg/mL 時，其DPPH清除率達到最高，為98%，而VC 在1 mg/mL 時DPPH 自由基清除率最高，為88.69%。

圖2 HWE 及陽性對照藥VC 的DPPH 自由基清除率

2.1.2 ABTS 及FRAP 抗 氧 化 能 力 測 定 圖3 為HWE 和VC 分別采用ABTS 法和FRAP 法測定的總抗氧化能力結果。由ABTS 法結果可以看出，HWE和VC 的ABTS 總抗氧化能力值分別為5.44 和6.51 mmol/g，VC 的ABTS 值高于HWE；由FRAP 法結果可以看出，HWE 和VC 的FRAP 總抗氧化能力值分別為0.79 和1.47 mmol/g，VC 的FRAP 值高于HWE。總體來看，VC 的總抗氧化能力強于HWE。

圖3 HWE 和VC 的FRAP 及ABTS 總抗氧化能力

2.2 HWE 的抑菌活性

2.2.1 紙片抑菌法活性測定 通過抑菌圈直徑的大小可將菌種對藥液的敏感程度分為高度敏感（＞20 mm）、中度敏感（14～20 mm）、低度敏感 （8～14 mm）和不敏感（＜8 mm）[20]。由表1 可知，當HWE 濃度為25 mg/mL 時，對4 種菌均表現為不敏感；當HWE的濃度為50 mg/mL 時，對枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌表現出低敏感；當HWE 的濃度為100 mg/mL時，對4 種菌均表現出低敏感；當HWE 濃度為200 mg/mL 時，對枯草芽孢桿菌和金黃色芽孢桿菌表現出中度敏感。總體來看，HWE 對4 種菌的敏感程度排序為金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞腸炎沙氏桿菌＞大腸桿菌，較高濃度的HWE 表現出較強的抑菌效果，但效果均差于鹽酸金霉素。

表1 HWE 對4 種試驗菌的抑菌圈直徑

2.2.2 MIC 與MBC 活性測定 通過二倍稀釋法可以得出HWE 對枯草芽孢桿菌、腸炎沙氏桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC 分別為12.5、6.25、3.12、12.5 mg/mL，MBC 值 分 別 為25、25、12.5、25 mg/mL。同時可以得出，鹽酸金霉素對枯草芽孢桿菌、腸炎沙氏桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的MIC 值均小于0.01 mg/mL，MBC 的值分別為0.04、0.04、0.04、0.02 mg/mL。

3 結論與討論

玫瑰茄水提取物具有較強的抗氧化活性，其抗氧化能力與VC 相當，對金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有一定的抑菌活性，雖然抑菌效果不及鹽酸金霉素，但其來源于天然植物，原材料豐富，且具有廉價、綠色、健康等優勢，可將其作為飼用抗氧化劑或抑菌防霉劑進行開發利用。

試驗所采用的DPPH 法與黃瓊等[21]的研究一致，且結果也相似，即陽性對照VC 的DPPH 自由基清除率均低于90%，且隨濃度的增加清除率無明顯增加；而HWE 對DPPH 的自由基清除率當其濃度為0.8 mg/mL 時達到最高值98%。試驗采用的FRAP 法和ABTS 法與王智勇等[22]和Zhang 等[11]的方法基本一致，其中2 種方法測定HWE 均表現出較強的抗氧化能力，這也與前人的研究基本一致。例如鄭大恒等[23]發現玫瑰茄粗多糖對DPPH、羥基、超氧陰離子自由基具有較強的清除作用，劉雨瀟等[24]發現玫瑰茄多酚含量與抗氧化能力呈量效關系。抑菌試驗中所采用的微量稀釋法與裴滬榮等[25]和邱亞鐵等[26]的研究一致，樣品均采用DMSO 助溶，其結果顯示，HWE 在抑制微生物生長方面表現出一定活性，抑菌能力與濃度呈較明顯的量效關系，其中HWE 對金黃色葡萄球菌的抑制效果最優，當其濃度為200 mg/mL 時，抑菌圈直徑達18.83±0.58 mm；而在MIC 及MBC 指標測定中，HWE 對大腸桿菌的抑制效果表現最好，其MIC 和MBC 值分別為3.12和12.5 mg/mL。李夢淼等[27]測定了玫瑰茄醇提物的抑菌活性，發現其表現出較好的抑菌效果，并通過紫外分光光度法測定出其主要抑菌活性物質為黃酮類化合物。Borrás–linares 等[28]的研究結果表明，玫瑰茄提取物對對革蘭氏陽性細菌的抑制作用更為顯著。

隨著“全面替抗”時代的到來，尋找天然無公害替代抗生素的添加物成為必然趨勢，植物提取物型飼料添加劑是極佳的選擇，也是今后飼料添加劑的主導方向。Saxena 等[29]證明了玫瑰茄提取物對不同階段絲蟲（幼蟲、成蟲）均具有殺滅作用，在250 mg/L 濃度下能體外殺死微絲幼，并認為將玫瑰茄開發成治療絲蟲病的有效藥物具有良好的前景。玫瑰茄也被證明具有開發成天然抑菌劑的應用前景[27-30]。該研究結果表明，玫瑰茄具備開發成抗氧化劑和抑菌劑的潛力，可作為抗氧化劑及抑菌防霉劑添加到飼料中，為進一步開發利用木槿屬植物提供了新思路。左苗[31]在飼料中添加一定量的玫瑰茄提取物，發現肉雞及鯰魚的生長性能均能得到一定的改善，這表明玫瑰茄在飼料添加劑上的開發與利用具有一定的可行性。