Lnc721靶向調控MMP9對牛骨骼肌衛星細胞增殖分化的影響

郭云鵬，譚皓云，郭宏，符夢云，李新，胡德寶，張林林，丁向彬，郭益文

Lnc721靶向調控MMP9對牛骨骼肌衛星細胞增殖分化的影響

郭云鵬，譚皓云，郭宏，符夢云，李新，胡德寶，張林林，丁向彬，郭益文

天津農學院動物科學與動物醫學學院/天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室，天津 300384

【背景】肌肉系統是維持動物體生存生長的重要基礎，在哺乳動物肌肉中，將近一半的肌肉為骨骼肌，骨骼肌通過細胞繁育增殖到遷移融合，逐步形成了具有收縮能力的附著在骨骼上的成熟肌束。在機體內，骨骼肌不僅參與動物生長，也參與呼吸、代謝等生理活動。目前許多研究表明，lncRNA具有調控肌肉生長發育的作用，是影響骨骼肌功能、疾病的關鍵因子。但由于lncRNA作用機制復雜，方式多樣，在物種間保守型很低，故不同種屬動物 lncRNA之間作用關系不大，且大多數研究存在于人和小鼠等生物體內，而對牛肌肉生長影響的研究內容極少。近年來，人們發現lncRNA會與某些靶基因相互作用，進而調控肌肉細胞的發生過程。【目的】在前期采集不同月齡不同組織部位的牛肌肉，進行高通量測序，獲得高表達差異的lncRNA，在對其調控成肌過程進行機制研究的基礎上，探究長鏈非編碼RNA lnc721與其靶基因MMP9的互作關系，以及MMP9對牛骨骼肌細胞生長發育的影響，以期為牛骨骼肌發育調控機制的研究提供參考。【方法】前期試驗發現干擾lnc721對牛骨骼肌衛星細胞增殖具有正調控作用，且對其分化具有負調控作用。為了進一步探究lnc721 對牛肌肉發育的調控通路。分別在牛骨骼肌衛星細胞的分化期設置了3 個干擾lnc721牛骨骼肌衛星細胞組，與3個對照組采用 NGS 技術進行轉錄組測序，以期獲得lnc721 差異靶基因，進一步研究lnc721 對牛骨骼肌發育的調控通路。根據篩選結果以及qRT-PCR的驗證結果，試驗選取MMP9作為lnc721的靶基因，并通過CatRAPID網站對lnc721與MMP9結合能力進行預測。設計并合成lnc721及MMP9干擾序列，轉染至牛骨骼肌衛星細胞中，通過qRT-PCR、Western blot技術在mRNA水平與蛋白質水平分析下調lnc721對MMP9表達情況的影響。并且通過下調MMP9，采用qRT-PCR、Western blot與EdU技術檢測增殖標志因子Ki67、Pax7以及分化標志因子MyHC與MyOG的表達情況，以反映下調MMP9對牛骨骼肌衛星細胞生長發育的影響。【結果】CatRAPID結果顯示，lnc721與MMP9結合傾向為0.75，共有9個結合位點，二者存在互作結合。干擾lnc721之后，采用qRT-PCR分析，結果表明在細胞增殖期下調lnc721可以極顯著抑制MMP9表達（＜0.01），而在分化期則極顯著促進MMP9的表達（＜0.01），證實了MMP9為lnc721調控牛骨骼肌衛星細胞互作的靶基因。進而下調MMP9，檢測對增殖期細胞的影響，發現Ki67的mRNA水平表達極顯著上調（＜0.01），Pax7蛋白表達量顯著上調（＜0.05），EdU觀察下調MMP9后的陽性細胞率也明顯升高。同樣檢測下調MMP9之后對細胞分化期的影響，發現下調MMP9后鏡下觀察發現下調MMP9會抑制肌管形成，同時MyHC的mRNA和蛋白表達量極顯著下降(＜0.01)， MyoG蛋白表達量顯著下調(＜0.05)。【結論】lnc721與MMP9相互結合。在細胞增殖期干擾lnc721極顯著抑制MMP9表達，而在分化期促進MMP9的表達，且干擾MMP9可促進細胞增殖并抑制分化。證明lnc721靶向MMP9調控牛骨骼肌衛星細胞的發育。

lnc721；MMP9；牛骨骼肌衛星細胞；增殖；分化

0 引言

【研究意義】牛骨骼肌作為人類優質蛋白質來源之一，其發生發育是一個極其精準且十分繁復的調控過程[1]。近年來有報道lncRNA會參與調控肌肉生長發育的過程，本文主要研究lncRNA對牛骨骼肌發生發育的調控機制，以期改善牛肉質量，為市場提供優質牛肉。【前人研究進展】Wang等[2]發現lncRNA Sirt1AS通過保護Sirt1 mRNA（細胞周期抑制劑的抑制因子）免受miR-34a介導的降解，促進成肌細胞增殖。同樣的lncRNA Mir22hg在肌母細胞分化過程中顯著上調，并在骨骼肌中高度表達。Li等[3]驗證了Mir22hg在體外可以促進肌母細胞分化。并且在機制上發現Mir22hg可以抑制其靶基因組蛋白脫乙酰酶4（HDAC4），從而增加下游肌細胞增強因子2C（MEF2C），最終促進肌母細胞分化。【本研究切入點】本研究團隊先前的研究已知，lnc721 的長度為 311 bp，在 NCBI 對比發現lnc721位于18號染色體，編號為OX344707.1，是一個未研究的 lncRNA。通過建立體外的lnc721干擾模型，并分析相關標志因子，發現干擾lnc721之后，肌肉細胞增殖期標志因子Pax7與Ki67表達水平均顯著上調，而分化期標志因子MyHC與MyoG表達水平均極顯著降低。證明lnc721參與調控了肌肉細胞的生長發育，但對其作用的分子機制并未探明。鑒于此，本研究選取前期研究的lnc721，通過抑制其表達后RNA測序獲得差異基因，篩選出與肌肉發育相關的差異基因，隨后根據剩余候選基因在測序結果中的差異表達倍數的高低，最終確定MMP9為最適基因。MMP9是MMPs家族明膠酶的成員中以被糖化的形式存在的酶[4-5]。基質金屬蛋白酶（MMPs）是一個龐大的家族[6-7]。自1962年MMPs被發現開始[8]，MMPs家族的28個成員[9]調控骨骼肌的功能被不斷發掘出來。有研究表明，MMPs通過促進細胞遷移和融合，在成肌細胞融合中發揮著重要的作用[10]。MMP13[11]、MMP14[12]等MMPs家族的成員也被證實會影響成肌細胞的增殖分化。【擬解決的關鍵問題】本試驗選取前期篩選的MMP9進行試驗，在體外建立MMP9的干擾模型，觀察MMP9對于骨骼肌衛星細胞增殖分化的影響，并探究MMP9與lnc721的互作結合關系，以期為研究MMP9在肌肉中發揮的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 本研究所用的細胞樣品為原代牛骨骼肌衛星細胞，細胞的分離培養凍存過程均由天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室完成。

1.1.2 試驗時間及地點 試驗地點為天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室，試驗時間為2021年至2022年12月。

1.1.3 主要試劑及儀器 Magna RIP? RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit購自Sigma-Aldrich公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒購自上海雅酶生物公司；MMP9抗體購自上海Abmart公司；Ribo? ASO-lncRNA與Cell-Light? EdU Apollo 567 In Vitro Kit均購自廣州銳博生物科技有限公司；0.25%胰蛋白酶、DAPI溶液、4%多聚甲醛與PMSF均購自北京Solarbio公司；ECL超敏發光液購自上海生物工程有限公司；提RNA試劑盒購自北京艾德萊公司；Lipofectamine? 3000轉染試劑購自Invitrogen公司；DMEM 高糖培養基購自Hyclone公司；Gel Extraction Kit、BCA 蛋白定量試劑盒與PBS 緩沖液均購自北京康為世紀公司；PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit購自大連Takara公司；正常山羊血清、鼠抗 MHC與鼠抗Pax7均購自DSHB公司；胎牛血清（FBS）、馬血清（HS）與opti-MEM培養基均購自Gibco公司；鼠抗GAPDH購自北京中杉金橋公司；羊抗鼠二抗和羊抗兔二抗均購自北京中杉金橋公司；NE-PER Nuclear and CytoplasmicExtraction Reagents Kit與蛋白Marker均購自Thermo-Scientific公司；All-in-One? qPCR Mix購自GeneCopoeia公司。

脫色搖床購自IKA公司；離心機購自Eppendorf公司；電泳儀購自PowerPac Basic公司；普通PCR儀與LightCycle 96 實時熒光定量PCR儀均購自Roche公司；二氧化碳培養箱購自SANYO公司；熒光顯微鏡購自Leica公司；高壓滅菌鍋購自TOMY公司；Nano-Drop ND 2000cSupectrophotometer購自Thermo公司；垂直電泳槽與ChemiDoc? Imaging System均購自Bio-Rad公司；酶標儀購自Thermo- scientific公司。

1.2 方法

1.2.1 MMP9的生物信息學篩選 構建lnc721干擾模型文庫，將原始數據進行分類統計，然后利用Cutadapt去除接頭序列及低于Q20的Reads，并對堿基質量及含量進行評估。通過HTSeq將過濾后的序列與牛全基因組進行比對，統計比對到每一個基因上Read Count值，并最終還原出轉錄本序列，接下來與已知的mRNA和LncRNA轉錄本進行比較，通過FPKM將表達量進行標準化處理，進一步分析基因間表達水平相關性。使用DESeq軟件包分析PCA主成分，通過繪制火山圖進一步分析表達差異結果。根據測序結果以及qRT-PCR結果最終選取MMP9為候選差異基因，并采用catRAPID在線軟件預測lnc721與MMP9的結合能力及結合位點。

1.2.2 培養基的制備 增殖培養基為10%胎牛血清（FBS）+10%DMEM，分化培養基為5%孕馬血清+95%DMEM。

1.2.3 細胞培養及誘導分化 復蘇原代細胞后使用增殖培養基進行原代、傳代培養，待細胞密度適宜時進行轉染處理，24 h后將培養基更換為分化培養基，每12 h觀察一次，直至肌管形成。

1.2.4 細胞轉染 待增殖期與分化期細胞密度約為60%時即可開始轉染，分別將3個合成的干擾序列與對照轉染至細胞當中，每組設置3個生物學重復，3條si-MMP9與一條lnc721干擾序列均由廣州瑞博生物技術有限公司設計并合成：si-bta-MMP9_001（si-1）：5′-AAGAAAUGCAAGCGGUUCC-3′；si-bta-MMP9_002（si-2）：5′-AUGUCGUGCGUGCUAAUGG-3′；si-bta- MMP9_003（si-3）：5′-UUGUCUUUGUCGAAGUUGG -3′；ASO-bta-lnc721_001：5′-TTTCAAGCAGCCAGAC AAAG-3′。

1.2.5 細胞總RNA的提取與cDNA的合成 分別收取增殖期（GM）與分化第一天（DM1）、第二天（DM2）、第三天（DM3）4個時期的細胞總RNA，利用HiFiScript cDNA Synthesis Kit進行cDNA第一鏈的合成，反應條件為 42 ℃ 15 min，84 ℃ 5 min。反應結束后，加無酶水稀釋5倍，裝入袋中標記批次及樣品，置于-20 ℃冰箱保存備用，為后續使用qRT-PCR技術提供原材料。

1.2.6 qRT-PCR 采用qRT-PCR技術檢測lnc721表達水平、MMP9表達水平得到干擾效率并檢測增殖期和分化期標志因子（Pax7、Ki67與MyHC、MyoG）的mRNA表達水平。引物序列（表1）均在NCBI中查詢得到，PCR反應體系共20 μL：2×All-in-One? qPCR Mix 10.0 μL；Forward primer (F) 0.5 μL；Reverse primer (R) 0.5 μL；cDNA template 2.0 μL；RNase Free dH2O 7.0 μL，PCR程序：預變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，共40個循環。結果采用2-△△Ct方法計算。

1.2.7 RIP 采用Magna RIP? RNA-Binding Protein Immunoprecipitation Kit 進行RIP 試驗。將細胞培養至分化第3天，加入預混的RIP裂解液冰上孵育5 min后-80 ℃保存。磁珠處理及免疫沉淀按照說明書操作后用Trizol法提RNA。

表1 qRT-PCR 引物序列

1.2.8 EdU檢測 試驗操作按照Cell-Light? EdU Apollo 567 In Vitro Kit說明書進行，接種至96孔板的細胞分為試驗組與空白組并設置3個生物學重復。在熒光顯微鏡下觀察拍照并計數。

1.2.9 Western blotting檢測 前期使用RIPA蛋白裂解液處理細胞，提取細胞蛋白后采用BCA法通過酶標儀測量蛋白濃度。采用Western blotting分別檢測內參與增殖期標志因子（Pax7、Ki-67）和分化期標志因子（MyHC、MyoG）。SDS-PAGE參數設定為80V 30 min，120V 45 min；轉膜參數設置為300mA 2 h。轉膜后在適宜位置裁剪條帶，于4℃冰箱中孵育一抗，12 h后使用TBST清洗3次后孵育相應二抗，1 h后使用TBST清洗3次，上機滴加ELC發光液曝光。

1.2.10 統計分析 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析。EdU陽性細胞率用卡方檢驗分析，qRT-PCR采用GAPDH 作為內參，2-ΔΔCt方法計算基因相對表達水平，t檢驗做差異顯著性分析。＜0.01表示差異極顯著（**），＜0.05表示差異顯著（*），＞0.05表示差異不顯著（N.S.），Western blotting條帶的量化采用Image J 軟件分析。

2 結果

2.1 lnc721基因特點

CPC網站預測lnc721編碼潛能為-1.33129（圖1-A）。核質分離試驗表明lnc721主要定位于細胞質內（圖1-B）。并且通過qRT-PCR技術驗證lnc721組織表達，發現其在3月齡胎牛、6月齡胎牛、9月齡胎牛及成年牛體內的各種組織中均有表達（圖2），在6月齡胎牛組織中表達量相對較低（圖2-B），而在9月齡初生牛犢肌肉組織內表達量較高（圖2-C）。表明lnc721主要在9月齡胎牛肌肉組織中高表達。

A：CPC 網站蛋白編碼能力預測；B：lnc721 亞細胞定位檢測 A: Prediction of CPC website protein coding ability; B: Subcellular localization detection of lnc721

A：3月齡胎牛；B：6月齡胎牛；C：9月齡胎牛；D：成年牛 A: 3-month-old fetus; B: 6-month-old fetus; C: 9-month-old fetus; D: Adult cattle

2.2 lnc721下游靶基因的篩選

實驗室前期已研究發現干擾lnc721對牛骨骼肌衛星細胞增殖具有正調控作用且對其分化具有負調控作用。為了進一步探究lnc721對牛肌肉發育的調控機制，通過對干擾lnc721后轉錄組測序結果進行過濾、質量評估、表達量以及表達差異分析,以|log2(Flodchange)| ≥1以及＜0.05為篩選條件篩選出差異基因并作出火山圖。采用NGS轉錄組測序，尋找lnc721調控的下游靶基因。結果發現，共有499個上調表達的差異基因，93個下調表達的差異基因(圖3)。

為驗證測序結果的準確性，在表達倍數較高的基因中選取了5個上調與4個下調差異基因，采用qRT-PCR技術對其mRNA水平進行驗證，結果如圖4所示，檢測9個差異基因，其中7個基因差異顯著且與測序結果一致，有2個基因差異不顯著，表明測序數據的可靠性。進一步對驗證的差異靶基因加以分析，并根據文獻及基因功能分析篩選出與肌肉發育相關的差異基因，根據基因差異表達倍數的高低，最終篩選MMP9為lnc721候選靶基因。

圖3 轉錄組測序基因表達差異分析火山圖

A：上調表達基因的qRT-PCR檢測；B：下調表達基因的qRT-PCR檢測

2.3 lnc721與候選基因結合的預測與驗證

網絡數據計算預測lnc721與MMP9的結合能力，結果指出lnc721與MMP9共有9個結合位點，結合傾向（RBP propensity）為0.75，（圖5），這一結果證實了差異高表達基因MMP9可作為lnc721互作蛋白進行后續功能性研究分析。

圖5 catRAPID預測lnc721與MMP9的結合位點

通過RIP測定MMP9免疫沉淀物上lnc721的富集程度來證明二者的結合關系。以10% input為陽性對照，以與MMP9一抗同種屬的IgG為陰性對照進行實驗。如圖6所示，lnc721富集于MMP9免疫沉淀物中，證明了lnc721與MMP9存在互作結合關系。

圖6 RIP檢測MMP9與lnc721相互關系

2.4 lnc721對MMP9表達的影響

經過上述試驗已經確定lnc721與MMP9存在互作關系，為了進一步研究二者的關系，干擾lnc721檢測MMP9的表達情況。將lnc721特異的siRNA序列轉染至細胞中，收取增殖期和分化期的mRNA與蛋白質，分別采用qRT-PCR與Western blotting技術檢測MMP9的表達情況。結果發現在下調lnc721之后，qRT-PCR結果顯示出在增殖期MMP9的表達被極顯著抑制（＜0.01），而分化期截然相反，MMP9的表達被極顯著促進（＜0.01）（圖7）；Western blotting結果表明下調lnc721之后，對于MMP9在增殖期與分化期表達情況的影響均不顯著，這可能與不同時期蛋白翻譯水平變化相關（圖7-B、C）。

2.5 干擾MMP9對牛骨骼肌衛星細胞增殖的影響

為了探究MMP9對牛骨骼肌生長發育的影響，設計合成3條干擾序列轉染到細胞中，培養至增殖期收取RNA，篩選出最佳干擾序列（圖8-A），qRT-PCR結果表明3條干擾序列均極顯著降低了MMP9的表達量（＜0.01）,證明3條干擾序列均構建成功。由于si-1干擾效果最佳，因此后續將si-1轉染進細胞中檢測增殖期標志因子Pax7和Ki67的表達情況。結果如圖8-B、D所示，干擾MMP9后Ki67的mRNA表達極顯著上調（＜0.01），而Pax7蛋白表達量沒有顯著變化。下調MMP9后采用EdU技術觀察陽性細胞，發現干擾組陽性細胞率也顯著高于對照組（圖8-C）。

A：下調lnc721后MMP9增殖期與分化期mRNA水平變化；B：增殖期下調lnc721，MMP9蛋白表達水平檢測；C：分化期下調lnc721, MMP9蛋白表達水平檢測

A：定量PCR篩選牛骨骼肌衛星細胞中MMP9干擾siRNA；B：qRT-PCR檢測增殖標志因子在mRNA表達水平；C：EdU染色增殖陽性細胞數 D：Western blotting檢測增殖標志因子 Pax7蛋白表達量

2.6 干擾MMP9對牛骨骼肌衛星細胞分化的影響

將MMP9的干擾序列轉染進細胞中，收取細胞分化3d（DM3）的RNA和蛋白質，收取前鏡下觀察發現下調MMP9會抑制肌管形成（圖9-A）。檢測分化期標志因子MyHC和MyoG的mRNA與蛋白質表達情況。下調MMP9后，MyHC的mRNA水平表達量顯著下降（＜0.01）（圖9-B），MyHC的蛋白表達量極顯著下降（＜0.01），MyoG蛋白表達量顯著下調（＜0.05）（圖9-C）。

A：轉染ASO-MMP9后，倒置顯微鏡觀察分化期細胞生長狀態（200×）；B：細胞分化標志因子mRNA表達水平；C：Western blotting檢測分化標志因子

3 討論

3.1 mRNA和蛋白質表達水平不一致

一般mRNA和蛋白質的表達水平應該有一定的比例關系，但是二者不一定完全一致，這可能與mRNA翻譯過程的調控與蛋白質的降解有關。真核生物的翻譯包括起始、延伸和終止[13-14]，翻譯的起始主要通過m7GpppN以帽蓋依賴的形式發生[15]，但是某些胞內核糖體會繞過該結構直接結合在起始密碼子上[16]，即KOZAK序列[17]。影響翻譯起始的因素有幾個，例如，核糖體可以與位于mRNA 5'UTR中的上游開放閱讀框（uorf）結合，并以競爭的方式改變主要開放閱讀框的翻譯水平；二級結構也通過減慢核糖體的傳代來影響翻譯，而次優的Kozak序列會對起始產生負面影響；翻譯延伸過程中三種主要的伸長因子（eEF1A, eEF1B和eEF2）在響應多種刺激時通過磷酸化/去磷酸化進行調節[18]。延伸率還受到起始速率的變化、密碼子的選擇以及相應的tRNA豐度的影響。再有蛋白質降解也有可能導致二者表達水平不一致，蛋白質降解是高度特異性和嚴格調控的，它包括兩個主要系統。溶酶體降解和泛素介導的內吞作用、胞飲作用、吞噬作用和自噬作用[19]。本試驗中干擾lnc721之后，在增殖期與分化期檢測了MMP9的表達水平，qRT-PCR結果顯示增殖期MMP9的mRNA表達水平極顯著降低（＜0.01），分化期MMP9的mRNA表達水平極顯著升高（＜0.01），然而Western blotting結果卻顯示干擾lnc721之后MMP9的蛋白質水平卻沒有顯著的變化。同樣的干擾MMP9之后。分化期標志因子MyOG的mRNA表達量沒有顯著變化而蛋白質水平顯著下調（＜0.05）。前者有可能是mRNA發生了轉錄后修飾，而后者發生了蛋白質的降解。

3.2 LncRNA通過靶蛋白調控肌肉生長發育

隨著學者對骨骼肌生長發育調控方式的深入研究，越來越多的lncRNA與靶蛋白的協同調控機理被發掘出來。Wang等[20]發現lnccDLEU2的過表達會促進SEPP1mRNA與蛋白水平，來抑制肌肉分化和再生。同樣的，Cai等[21]發現過表達lncORA可以抑制肌肉分化，并且lncORA可以與IGF2BP2相互作用，抑制肌肉生長發育。CHEN等[22]發現被敲低干擾和過表達lncKBTBD10，均會抑制牛骨骼肌衛星細胞的增殖和分化。同時檢測lncKBTBD10的鄰近基因KBTBD10是否參與肌生成，發現，無論 lncKBTBD10 被敲低還是過表達，KBTBD10 的蛋白水平均降低。研究認為lncKBTBD10可以抑制KBTBD10，進而影響牛骨骼肌的生成[23]。本研究前期發現lnc721正向調控骨骼肌的增殖，負調控牛骨骼肌的分化。在此基礎上，通過lnc721轉錄組測序鎖定了候選下游基因MMP9，并通過RIP實驗驗證了lnc721與MMP9相互結合。通過qRT-PCR檢測干擾lnc721對MMP9的影響，結果發現在細胞分化期干擾lnc721后顯著促進了MMP9的表達，推測lnc721可能通過MMP9影響肌衛星細胞生長發育。

3.3 MMP9對肌肉細胞增殖分化具有顯著調節作用

MMP9是最復雜的基質金屬蛋白酶形式之一。MMP9具有降解細胞外基質（ECM）成分的能力，在病理生理功能中具有重要作用，MMP9的過表達和失調與各種疾病有關[24]。比如心力衰竭[25]、胃癌[26]、肝癌[27]等。研究發現過表達腫瘤壞死因子相關的弱凋亡誘導劑（TWEAK）會增加基質金屬蛋白酶（MMP）在骨骼肌細胞肌管中的表達。TWEAK轉基因小鼠的肌纖維中MMP9的水平也較高。TWEAK增加了核因子-kappaB（NF-kappaB）信號通路的激活。干擾NF-kappaB 活性阻止了TWEAK誘導的肌管中 MMP9 的產生。此外，據大量研究報道，MMP9對骨骼肌發育也具有調控作用[28]。LI等[29]已在mdx小鼠中研究了MMP9在肌肉功能中的合作相互作用，其中MMP9活性的抑制導致骨骼肌結構惡化，壞死和纖維化減少，并對骨骼肌再生具有補救作用。同樣的，KHERIF等[30]在肌營養不良蛋白缺陷MDX小鼠的骨骼肌中觀察到MMP9的上調。此外，據報道，MMP9能夠處理β-肌營養不良聚糖，并通過DMD和肌糖病患者骨骼肌中的肌營養不良聚糖復合物破壞ECM與細胞膜之間的連接，從而干擾肌肉細胞的生長發育[31-32]。CHENETTE等[33]研究敲除小鼠auf1基因后，骨骼肌會隨小鼠年齡的增長而萎縮，在auf1敲除小鼠中阻斷MMP9活性可恢復骨骼肌修復。ZIMOWSKA等[34]在擠壓損傷大鼠SOL模型中證實了MMP9抑制對肌肉再生正向調節的作用，特別是對減少纖維化的正向調節作用。本研究重點關注MMP9與骨骼肌生長發育之間的關系，進一步驗證MMP9是否對牛骨骼肌衛星細胞具有調控作用。使用MMP9的siRNA干擾MMP9后，qRT-PCR結果與WB結果均顯示顯著促進了細胞的增殖，并抑制細胞分化，此結果與lnc721下調會使細胞分化受阻結果相一致。故而lnc721與MMP9對牛肌衛星細胞調控趨勢一致，lnc721可以結合MMP9蛋白，共同作用對細胞增殖有正向調控的作用，對細胞分化過程具有負向調控的作用。綜合前期研究結果，本試驗證明了lnc721與MMP9結合參與了肌肉細胞發育初期的調控，揭示了lnc721調控牛肌衛星細胞增殖分化的機制。

4 結論

干擾lnc721在細胞增殖期極顯著抑制MMP9表達，而在分化期促進MMP9的表達，且干擾MMP9可升高增殖期標志因子Pax7與Ki67D的表達水平并下調分化標志因子MyHC與MyoG的表達水平。證明了MMP9具有可負向調控細胞增殖并正向調控細胞分化的作用。結合lnc721與MMP9的調控關系，可以得出結論lnc721促進MMP9的表達進而對細胞的增殖起到抑制作用，對細胞分化起到促進作用，lnc721與MMP9互作結合共同調控牛骨骼肌衛星細胞的發育。

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LNC721 Targeted Regulation MMP9 Affects Bovineskeletal Muscle Satellite Cell Proliferation and Differentiation

GUO YunPeng, TAN HaoYun, GUO Hong, FU MengYun, LI Xin, HU DeBao, ZHANG LinLin, DING XiangBin, GUO YiWen

School of Animal Science and Animal Medicine, Tianjin Agricultural College/Tianjin Key Laboratory of Agricultural Animal Breeding and Healthy Husbandry, Tianjin 300384

【Background】The muscular system is an important basis for maintaining the survival and growth of the animal body. In the mammalian muscle, nearly half of the muscle is skeletal muscle, skeletal muscle through cell multiplication to migration fusion, and gradually formed a mature muscle bundle attached to the bone with contractile ability. In the animal body, skeletal muscle is not only involved in animal growth, but also in physiological activities, such as respiration and metabolism. At present, many studies have shown that lncRNA had the effect of regulating muscle growth and development, and was a key factor affecting skeletal muscle function and diseases. However, due to the complex mechanism of action of lncRNA, the variety of methods, and the very low conservation type between species, the relationship between lncRNAs of different species is not large, and most of the studies exist in organisms such as humans and mice, and there are few studies on the effect on bovine muscle growth. In recent years, it has been discovered that lncRNAs interact with certain target genes to regulate the process of muscle cell genesis. In the early stage of this experiment, the high-throughput sequencing was performed by collecting bovine muscles of different tissues of different months, the lncRNA with high expression difference was obtained, and the mechanism of its regulation of the myogenic process was studied. 【Objective】This study aimed to explore the interaction between long non-coding RNA lnc721 and its target gene MMP9, and the effects of MMP9 on the growth and development of bovine skeletal muscle cells, in order to provide a reference for the study of the regulatory mechanism of bovine skeletal muscle development.【Method】 The previous experiments showed that interference with lnc721 had a positive regulatory effect on the proliferation of bovine skeletal muscle satellite cells and negatively regulated its differentiation. Three groups of interfering lnc721 bovine skeletal muscle satellite cells and three control groups were set up to sequence transcriptome using NGS technology in the differentiation stage of bovine skeletal muscle satellite cells, in order to obtain the lnc721 differential target gene and to further study the regulatory pathway of lnc721 on bovine skeletal muscle development. According to the screening results and the verification results of qRT-PCR, MMP9 was selected as the target gene of lnc721, and the binding ability of lnc721 and MMP9 was predicted through the CatRAPID website. The interference sequences of lnc721 and MMP9 were designed and synthesized, transfected into bovine skeletal muscle satellite cells, and the effect of lnc721 on MMP9 expression was down-regulated by qRT-PCR and Western blot technology at the mRNA level and protein level. After down-regulation of MMP9, qRT-PCR, Western blot and EdU were used to detect the expression of proliferation marker factors Ki67 and Pax7 and differentiation marker factors MyHC and MyOG, so as to reflect the effect of down-regulation of MMP9 on the growth and development of bovine skeletal muscle satellite cells. 【Result】 MMP9 was identified as a target gene for lnc721 to regulate the interaction of bovine skeletal muscle satellite cells. They were found to interact and bind to each other by RIP. After interfering with lnc721, qRT-PCR analysis showed that down-regulation of lnc721 significantly inhibited MMP9 expression (＜0.01) during the proliferative phase, while it significantly promoted MMP9 expression (＜0.01) during the differentiation phase. Downregulation of MMP9 resulted in a highly significant upregulation of Ki67 mRNA level expression in proliferating cells (＜0.01) and the Pax7 protein expression (?0.05). As also, it could significant increase the positive cell rate of EdU labled cells. At the stage of cell differentiation, the downregulation of MMP9 could inhibit muscle myotube formation. On the other hand, the mRNA and protein expressions of MyHC were significantly decreased (＜0.01); MyoG protein expression was significantly down-regulated (＜0.05). 【Conclusion】 lnc721 could bind to MMP9. Interfering with lnc721 was significantly inhibited MMP9 expression during the proliferative phase of cells, while promoting MMP9 expression during the differentiation phase. MMP9 inhibition could promoted cell proliferation and inhibited differentiation. This study demonstrated that lnc721 targeting MMP9 regulated the development of bovine skeletal muscle satellite cells.

lnc721; MMP9; bovine skeletal muscle satellite cells; proliferation; differentiation

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.24.012

2023-05-06；

2023-07-04

天津市農業動物繁育與健康養殖重點實驗室開放基金課題、天津市自然基金（20JCQNJC00640）、天津市教委科研計劃項目（2020KJ089）

郭云鵬，E-mail：guoyunpeng1225@163.com。通信作者郭益文，E-mail：yiwenguo33@163.com

（責任編輯 林鑒非）