湯陰北艾治療家兔慢性咽炎效果觀察

馬圣明，蔣志惠，谷令彪，翁少亭，邢月騰，趙國鋒，張坤朋

（1.安陽工學院，河南省獸用生物制品研發與應用國際聯合實驗室，河南 安陽 455000；2 安陽九頭仙艾業有限公司，河南 安陽 455000）

艾草（Artemisia argyi H. Lév. & Vaniot）是我國傳統道地中藥，別名艾蒿、白蒿、冰臺、灸草、艾絨等，為菊科蒿屬植物，因其全草入藥，藥圣李時珍稱其為草藥，也有草中鉆石的稱號[1-2]。古籍中將艾分為北艾、海艾和薊艾3 類，其中北艾（Artemisia argyi L. cv. Beiai）為模式種，主要分布在亞洲、歐洲及北美的溫帶、寒溫帶及亞熱帶地區[3]。我國艾草有186 種，44 變種，隸屬于2 個亞屬，廣泛分布于我國的東北、華北、華東和華南和西南等各省區[4]。北艾與海艾、蘄艾、祁艾合稱中國歷史上的“四大名艾”。特別值得關注的是，湯陰北艾是河南省地方特產道地中藥材，種植面積大、產量高，為國家地理標志保護產品，富含多種藥理活性成分，具有抗炎、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理學作用[5-7]。

慢性咽炎（Chronic pharyngitis）是咽部黏膜以及黏膜下淋巴組織的慢性炎癥，通常是上呼吸道慢性炎癥的一部分[8]。中醫認為，慢性咽炎屬于一種痰凝氣聚的情志性疾患，也被稱為“梅核氣”，主要與情志不暢關系比較密切。慢性咽炎的主要臨床表現為咽部不適、咽干癢、紅腫、分泌物多而灼痛、易干惡，有異物感等癥狀[9]。急性咽炎反復發作、空氣干燥、粉塵和刺激性氣體污染等均可導致慢性咽炎的發生[10-11]。從天然植物中尋找安全、高效的抗炎成分，是開發新型抗炎藥物的重要途徑。研究證據表明，艾草中的多種活性成分可抑制巨噬細胞釋放炎癥介質和炎癥組織中炎癥細胞因子的產生，從而發揮抗炎作用[12-14]。基于此，本研究建立家兔慢性咽炎動物模型，通過藥效學實驗研究及治療效果觀察，探討湯陰北艾治療家兔慢性咽炎的效果，以期豐富湯陰北艾抗炎藥理活性的基礎研究數據，為臨床應用北艾防治慢性咽炎治療藥物的開發提供重要科學依據。

1 材料與方法

1.1 北艾和家兔

湯陰北艾采集自河南省湯陰縣伏道鎮，經晾曬風干后，用粉碎機制備成粉劑；3 月齡健康家兔40 只，雌雄各半，（1.93±0.19 ）kg。

1.2 主要試劑

氨水（CAS NO：941116）購自四川省德陽市化學試劑廠；松節油（CAS NO：8000-41-7）購自天津市大茂化學試劑廠；喉頭噴霧器購自云南晨業醫療器械有限公司；RNA isolater Total RNA Extraction Reagent（R401-01）、HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）（R323-01）、ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix （Q711-02）均購自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.3 家兔慢性咽炎造模及樣品采集

40 只家兔隨機分為正常組、自然恢復組、北艾組和金銀花組，每組10 只。其中，自然恢復組、北艾組和金銀花組家兔均為慢性咽炎造模組。慢性咽炎造模方法為：家兔連續用2.5%氨水噴其咽部14 d，2 次/d；第8 天時，用扁桃體注射針將0.5 mL 松節油注射于家兔咽部黏膜下。造模完成后，隨機處死造模組和正常組家兔各1 只，取咽喉部組織制備病理切片，觀察咽部組織病理學變化。隨后，北艾組和金銀花組家兔分別用北艾粉、金銀花粉連續飲水給藥14 d，而自然恢復組正常飲水。在整個試驗周期內，正常組家兔常規飼養。觀察、記錄各組家兔造模前后的臨床癥狀、咽部的粘膜形態、色澤及分泌物情況，并測量體質量、體溫。在造模完成后，隨機挑選造模組和正常組家兔各5 只，采集耳緣靜脈血樣，檢測血常規變化，并采集家兔咽組織，制備切片，HE 染色后作病理形態學觀察。

1.4 炎性因子qPCR 檢測

利用PrimerPremier 5.0 軟件設計兔TNF-α、IL-1β、IL-6 和GAPDH 基因的特異性引物對（表1），上述引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。根據RNA isolater Total RNA Extraction Reagent 試劑盒說明書按TRIzol 法提取樣品中的RNA。參照HiScript III RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）試劑盒說明書計算cDNA 合成體系。參照ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 說明書配制qPCR 反應體系。使用iQ5 iCycler 檢測系統（Bio Rad）進行qPCR反應，程序為95℃、30 s；95℃、5 s；60℃、30 s，共 40 個循環，熔解曲線的程序為95℃、15 s；60℃、60 s，1.75℃/min 升溫至 95℃，維持15 s，升溫過程通過連續采集熒光信號生成熔解曲線。每個待測基因均做3 個qPCR 技術重復，并計算平均值，選擇對照組，采用2-ΔΔCT 法計算待測基因的相對表達水平，ΔΔCT=（實驗組目的基因CT 值-實驗組內參CT 值）-（對照組目的基因CT 值-對照組內參基因CT）。

表1 qRT-PCR 分析基因的特異性引物對

1.5 數據分析與處理

數據用平均值±標準差（SD）表示，用Graph Pad Prism 6 軟件中的two-way ANOVA 方法計算P 值并分析差異顯著性。**P < 0.01 表示差異極顯著；*P < 0.05 表示差異顯著；#P ≥ 0.05表示差異不顯著。

2 結果

2.1 慢性咽炎家兔模型的建立

3 月齡家兔在氨水和松節油造模后3 d 內采食量及精神狀態基本正常，此后部分家兔陸續出現活動減少、精神萎頓、搔抓口部、采食量下降、飲水頻繁而量少、咽部充血等臨床癥狀。而在整個實驗周期內，正常組家兔生長正常。第15 天分別隨機處死造模組和正常組家兔各1 只，取咽喉部組織制備病理切片，觀察咽部組織病理學變化。結果顯示，造模組家兔咽部組織大面積壞死，大量的細胞核固縮深染、破裂或溶解消失，與周圍組織融合呈無結構的嗜酸性物，且周圍伴有大量的中性粒細胞彌漫性浸潤；而正常組家兔咽部組織未見明顯異常和炎性改變（圖1）。結果表明，家兔慢性咽炎模型造模成功。

圖1 正常組與造模組家兔咽部組織病理圖（H.E.染色，100×）

2.2 臨床癥狀

造模完成后，北艾組在連續給藥4 d 后，家兔的活動量、精神狀態、采食量、飲水量等逐漸恢復正常，且在北艾治療給藥后第10 天，家兔咽部充血癥狀完全消失。金銀花組家兔在治療后第3 天，慢性咽炎癥狀逐漸緩解，并在金銀花連續治療8 d 后，上述癥狀體征基本恢復正常。而自然恢復組家兔在造模完成后第14 天，上述臨床癥狀體征雖有所恢復，但仍具有慢性咽炎臨床表現。在整個實驗周期內，正常組家兔臨床體征正常，未出現異常表現。結果表明，北艾和金銀花給藥均能有效緩解家兔慢性咽炎的臨床癥狀。

2.3 體質量及體溫

家兔在造模第4 天開始，體質量逐漸下降，造模完成后體質量平均下降0.12 kg。造模完成后給藥治療14 d，北艾組、金銀花組和自然恢復組家兔體質量均逐漸回升。其中，藥物治療14 d 后，北艾組、金銀花組和自然恢復組家兔體質量分別增加0.08 kg、0.09 kg 和0.04 kg。而正常組在整個實驗周期內，體質量持續上升，在實驗周期結束時體重平均增加0.19 kg（表2）。此外，我們檢測家兔的體溫發現，家兔在造模期間體溫持續處于較高的水平（＞38.86 ℃），造模結束后，用北艾或金銀花治療的家兔體溫逐漸恢復到正常體溫（約38.5 ℃），而正常組家兔在整個實驗周期內體溫相對恒定（約38.5 ℃）（表3）。上述結果表明，北艾和金銀花給藥均能有效促進慢性咽炎家兔增重，維持恒定體溫。

表2 各組家兔體質量變化 kg

表3 各組家兔體溫變化 ℃

2.4 白細胞分類計數

造模完成后，隨機挑選造模組和正常組家兔各5 只，采集耳緣靜脈血樣，檢測血常規變化。結果顯示，與正常組相比，造模組家兔白細胞（WBC）總數增多，嗜中性粒細胞降低，而淋巴細胞和單核細胞增加。與自然恢復組相比，在用北艾和金銀花給藥治療后，北艾組和金銀花組家兔白細總數減少，嗜中性粒細胞增多，淋巴細胞和單核細胞減少（表4）。結果顯示，北艾和金銀花給藥可有效改善慢性咽炎家兔白細胞分類情況。

表4 各組家兔白細胞分類計數

2.5 組織病理切片

造模完成后，隨機挑選造模組和正常組家兔各3 只，采集家兔咽組織，制備切片作病理形態學觀察。結果顯示，自然恢復組家兔咽部組織大面積壞死，大量的細胞核固縮深染、破裂或溶解消失，與周圍組織融合呈無結構的嗜酸性物，且周圍伴有大量的中性粒細胞彌漫性浸潤；北艾組和金銀花組家兔咽部組織上皮完整，有小面積水腫，結蹄組織排列疏松，并伴有少量淋巴細胞浸潤；而正常組家兔咽部組織未見明顯異常和炎性改變（圖2）。結果提示，北艾和金銀花給藥可有效減輕慢性咽炎家兔充血腫脹癥狀，改善咽部組織病變情況。

圖2 各組家兔咽部組織病理圖（H.E.染色，100×）

2.6 炎癥因子表達（mRNA 轉錄水平）

采集各組家兔咽部組織制備RNA，用qRTPCR 法檢測各組樣品炎性因子基因TNF-α、IL-1β和IL-6 的轉錄水平。結果顯示，造模組家兔TNF-α、IL-1β和IL-6 基因轉錄水平顯著高于正常組，而北艾組和金銀花組TNF-α、IL-1β和IL-6 基因轉錄水平顯著低于自然恢復組（圖3）。結果顯示，北艾和金銀花給藥可有效抑制慢性咽炎家兔炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6 的轉錄水平。

圖3 各組家兔咽部組織炎性因子的轉錄水平

3 討論

慢慢性咽炎為咽黏膜、黏膜下及淋巴組織的慢性炎癥[8]。此前研究證據表明，艾草對多種炎性病理反應具有調節作用。艾草活性成分通過調控多種代謝通路，抑制巨噬細胞釋放炎癥介質和炎癥組織中炎癥細胞因子的產生發揮抗炎作用[12-14]。據此，本研究建立了家兔慢性咽炎模型，通過藥效學實驗研究及治療效果觀察，探討湯陰北艾治療家兔慢性咽炎的效果。

根據慢性咽炎的病癥及發病原因，我們用氨水和松節油復合因素建立了3 月齡家兔慢性咽炎動物模型。氨水是堿性刺激物質，局部噴霧反復刺激可引起咽部黏膜充血水腫，誘發慢性炎癥。而松節油是一種油質化學因子，在黏膜下注射松節油，讓組織對其緩慢吸收，能達到對咽部持續刺激的作用，符合慢性咽炎的發病因素[15]。我們用氨水和松節油直接作用于家兔咽部，結果發現造模組家兔陸續出現活動減少、精神狀態委頓、搔抓口部、采食量下降、飲水頻繁而量少、咽部充血等與慢性咽炎相符的臨床癥狀。此外，進一步的病理形態學觀察結果顯示，造模組家兔咽部組織大面積壞死，大量的細胞核固縮深染、破裂或溶解消失，與周圍組織融合呈無結構的嗜酸性物，且周圍伴有大量的中性粒細胞彌漫性浸潤；與《中藥新藥治療慢性咽炎的臨床指導研究原則》中慢性咽炎病理形態一致，而正常組家兔咽部組織未見明顯異常和炎性改變，提示本實驗成功建立家兔慢性咽炎模型。

湯陰北艾是中國四大名艾之首，其化學成分主要為揮發油類、黃酮類和多糖三大類，具有抗炎、抗病毒、抗菌、免疫調節等多種藥理活性[3-6]。金銀花因具有清熱解毒、清咽利喉、化痰止咳的功效已廣泛應用于臨床，在急性、慢性咽炎的治療中有較好的療效。據此，本研究選取了金銀花粉為陽性對照組。在用北艾粉和金銀花粉連續飲水給藥治療后，家兔慢性咽炎癥狀逐漸緩解，且能促進家兔增重，維持恒定體溫。現代醫學研究表明，慢性咽炎的發生白細胞損害或激活，以及TNF-α、IL-1β、IL-6 等炎癥因子基因的過度表達密切相關。TNF-α是由活性T 細胞和巨噬細胞產生，具有促進炎癥細胞聚集活化及釋放炎癥介質的作用，是炎癥反應的起始因子[16]。IL-1β可通過激活內皮細胞增加誘導細胞間黏附分子的表達，誘發炎癥反應，與TNF-α的釋放相互促進，是引起發熱等炎癥反應的誘因[17]。IL-6 是導致機體內環境紊亂主要外因之一，可調節免疫應答，并介導炎癥反應的發生[18]。本研究發現，北艾粉飲水給藥治療可有效減輕慢性咽炎家兔充血腫脹癥狀，顯著改善咽部組織炎癥病理反應和白細胞分類情況。同時，TNF-α、IL-1β和IL-6 轉錄水平顯著低于自然恢復組。有意思的是，同等劑量下，與陽性對照組金銀花粉飲水給藥相比，北艾粉飲水給藥取得了同樣的治療效果，二者間的各項病理指標變化并無顯著差異。因此，湯陰北艾能夠有效緩解慢性咽炎癥狀，可作為慢性咽炎的潛在治療藥物，其藥物靶點及確切藥效機理仍有待進一步研究。