miRNA-574-5p和HMGB1在急性呼吸窘迫綜合征中的臨床意義*

段松堂,盧 威,喻 巍,左姍姍

1.長(zhǎng)江航運(yùn)總醫(yī)院重癥監(jiān)護(hù)室,湖北武漢 430040;2.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院重癥二科,河北石家莊 050000

急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)以急性炎癥肺損傷和低氧性呼吸衰竭為特征,隨著肺部對(duì)局部炎癥或全身炎癥刺激產(chǎn)生的過(guò)度免疫反應(yīng)而發(fā)展,影響全球大約10%的重癥監(jiān)護(hù)室成人患者,其住院病死率達(dá)到40%[1-2]。當(dāng)前需要尋找新的生物標(biāo)志物為預(yù)防和治療ARDS提供潛在的治療靶點(diǎn)。微小RNA(miRNA)是長(zhǎng)度為18～24個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA,通過(guò)抑制目標(biāo)mRNA翻譯或通過(guò)靶向互補(bǔ)mRNA進(jìn)行早期降解來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)[3]。miRNA被證明參與各種炎癥疾病狀態(tài),可能在ARDS的病理生理過(guò)程中發(fā)揮作用,可能是有吸引力的靶向治療候選物[4]。miR-574-5p被報(bào)道在多種疾病中發(fā)揮作用,如冠心病、肝細(xì)胞癌等[5-6]。高遷移率蛋白1(HMGB1)是典型的DNA結(jié)合核蛋白,介導(dǎo)感染和組織損傷中的炎癥,在ARDS中大量釋放[7]。據(jù)研究報(bào)道,HMGB1水平與重癥肺炎并發(fā)ARDS、膿毒癥合并ARDS等炎癥疾病密切相關(guān)[8-9]。上述研究提示miR-574-5p、HMGB1可能在ARDS的病理過(guò)程中具有重要的作用。本研究檢測(cè)了ARDS患者血清miR-574-5p、HMGB1水平,旨在探討其在ARDS中的意義,為制訂新的ARDS治療策略提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年6月至2018年6月長(zhǎng)江航運(yùn)總醫(yī)院收治的94例ARDS患者作為觀察組,其中男53例、女41例,平均年齡(44.65±11.76)歲,平均體重指數(shù)(22.87±2.19)kg/m2,吸煙32例,急性生理學(xué)與慢性健康狀況評(píng)分Ⅱ(APACHEⅡ)評(píng)分(21.62±7.15)分,依據(jù)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)將ARDS患者分為:輕癥組38例,血氧分壓(PaO2)/吸入氣中的氧濃度分?jǐn)?shù)(FiO2)在201～300 mmHg;中癥組29例,PaO2/FiO2在101～<201 mmHg;重癥組27例,PaO2/FPiO2<101 mmHg[10]。納入標(biāo)準(zhǔn):所有患者符合ARDS診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]且均為第一次確診,住院時(shí)間≥1周,年齡在18周歲以上,心肺功能正常,臨床資料齊全,簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn):合并嚴(yán)重感染性疾病、腫瘤或其他疾病的患者。另納入同期于長(zhǎng)江航運(yùn)總醫(yī)院體檢的65例體檢健康者作為對(duì)照組,其中男38例、女27例,平均年齡(43.24±12.60)歲,平均體重指數(shù)(23.06±2.05)kg/m2,吸煙14例。兩組性別、年齡等比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。所有受試者均簽署了知情同意書(shū)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員機(jī)構(gòu)的批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào):20170425)。

1.2方法 收集觀察組入院24 h內(nèi)及對(duì)照組體檢當(dāng)天的空腹肘靜脈血5 mL,在4℃條件下進(jìn)行離心10 min,轉(zhuǎn)速為3 000 r/min。收集上層血清,分裝到離心管并轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存待測(cè)。

1.3觀察指標(biāo) 采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)血清miR-574-5p。根據(jù)試劑盒的說(shuō)明書(shū),使用Trizol試劑(貨號(hào):10296028,購(gòu)于賽默飛世爾科技有限公司)提取血清總RNA。使用NanoDrop ND-1000分光光度計(jì)(購(gòu)于北京凱樂(lè)博科技發(fā)展有限公司)檢測(cè)總RNA濃度和純度。檢測(cè)合格的RNA樣品,使用promega逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號(hào):A3500,購(gòu)于上海聯(lián)碩生物科技有限公司)將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。將獲得的cDNA按照TB Green?Premix Ex Taq Ⅱ Kit(貨號(hào):RR820A,購(gòu)于日本TaKaRa公司)試劑盒說(shuō)明書(shū),在ABI7500熒光定量系統(tǒng)上通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行表達(dá)分析,反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s 40個(gè)循環(huán),60 ℃退火34 s。引物序列見(jiàn)表1,干粉由上海生工公司合成。以U6為內(nèi)參基因,使用2-ΔΔCt方法計(jì)算miR-574-5p的相對(duì)表達(dá)水平。采用HMGB1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒(貨號(hào):YM-QP11257,購(gòu)于上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司)檢測(cè)血清HMGB1水平,具體操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

表1 引物序列

1.4隨訪 從患者入院第二天開(kāi)始進(jìn)行追蹤隨訪,記入院28 d的生存狀況。

2 結(jié) 果

2.1觀察組和對(duì)照組血清miR-574-5p、HMGB1水平比較 與對(duì)照組比較,觀察組血清miR-574-5p和HMGB1水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 觀察組和對(duì)照組血清miR-574-5p、HMGB1水平比較

2.2不同病情嚴(yán)重程度患者血清miR-574-5p、HMGB1水平比較 不同病情嚴(yán)重程度患者血清miR-574-5p、HMGB1水平比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);中癥組患者血清miR-574-5p、HMGB1水平高于輕癥組,且重癥組高于中癥組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 不同病情嚴(yán)重程度患者血清miR-574-5p、HMGB1水平比較

2.3觀察組血清miR-574-5p、HMGB1水平與APACHEⅡ評(píng)分的相關(guān)性分析 觀察組血清miR-574-5p、HMGB1水平與APACHEⅡ評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.529,P<0.001;r=0.583,<0.001),見(jiàn)圖1。

注:A為miR-574-5p與APACHEⅡ評(píng)分的相關(guān)性;B為HMGB1水平與APACHEⅡ評(píng)分的相關(guān)性。

2.4觀察組血清miR-574-5p水平與HMGB1的相關(guān)性分析 觀察組血清miR-574-5p水平與HMGB1呈正相關(guān)(r=0.422,P<0.001),見(jiàn)圖2。

圖2 血清miR-574-5p水平與HMGB1相關(guān)性的散點(diǎn)圖

2.5不同預(yù)后患者血清miR-574-5p、HMGB1水平及APACHEⅡ評(píng)分比較 根據(jù)28 d隨訪結(jié)果,可將ARDS患者劃分為生存組(59例)和死亡組(35例),生存組患者血清miR-574-5p、HMGB1水平及APACHEⅡ評(píng)分均低于死亡組(P<0.05),見(jiàn)表4。

表4 不同預(yù)后患者血清miR-574-5p、HMGB1水平及APACHEⅡ評(píng)分比較

2.6多因素Cox回歸分析ARDS患者生存的影響因素 多因素Cox回歸分析結(jié)果顯示,APACHEⅡ評(píng)分及血清miR-574-5p、HMGB1水平均為影響ARDS患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05),見(jiàn)表5。

表5 多因素Cox回歸分析ARDS患者生存的影響因素

3 討 論

在過(guò)去的50年里,臨床工作者對(duì)ARDS的流行病學(xué)、病理生理學(xué)和發(fā)病機(jī)制有了更多的了解,從而制訂了新的治療策略,明顯提高了ARDS患者的生存率。然而,重癥ARDS的病死率仍居高不下,因此早期評(píng)估ARDS的危險(xiǎn)分層和優(yōu)化管理對(duì)于改善預(yù)后至關(guān)重要。

據(jù)報(bào)道,miRNA的表達(dá)失調(diào)嚴(yán)重影響了ARDS患者的病情發(fā)展和預(yù)后[11]。miR-574-5p位于人類(lèi)4號(hào)染色體上,在多種疾病中發(fā)生變化。研究發(fā)現(xiàn),miR-574-5p在宮頸癌患者的血清中高表達(dá),作為促癌基因參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展[12]。楊曉偉等[5]報(bào)道,miR-574-5p在冠心病患者的血清和平滑肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),可能是潛在的診斷生物標(biāo)志物。本研究結(jié)果顯示,ARDS患者血清中miR-574-5p水平升高,與楊曉偉等[5]研究報(bào)道的結(jié)果類(lèi)似,提示miR-574-5p的表達(dá)可能與ARDS的發(fā)生相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),miR-574-5p水平隨著病情嚴(yán)重程度加重逐漸升高,并且與APACHEⅡ評(píng)分呈正相關(guān),APACHEⅡ評(píng)分越高,則患者病情越重,是評(píng)估ARDS危重癥患者預(yù)后的重要參照依據(jù),說(shuō)明miR-574-5p的表達(dá)可能與ARDS的嚴(yán)重程度有關(guān)。死亡組miR-574-5p水平明顯高于生存組,結(jié)果表明,miR-574-5p可能與ARDS患者的預(yù)后有關(guān)。以上結(jié)果表明miR-574-5p有作為ARDS患者病情評(píng)估和預(yù)后預(yù)測(cè)的潛力。

血清HMGB1作為一種炎癥介質(zhì),可加重炎癥損傷從而誘發(fā)ARDS或致死性炎癥反應(yīng)[13]。既往報(bào)道表明,HMGB1水平升高與多種疾病相關(guān),能反映炎癥和組織損傷的嚴(yán)重程度,可作為生物標(biāo)志物來(lái)預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展。郭小芙等[14]發(fā)現(xiàn),膿毒癥合并ARDS患者血清中HMGB1水平升高,是膿毒癥患者并發(fā)ARDS的危險(xiǎn)因素之一,能作為早期預(yù)測(cè)ARDS的參考指標(biāo)。另一項(xiàng)研究也報(bào)道了血漿HMGB1水平升高與ARDS患者的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后有關(guān)[15]。本研究與上述研究結(jié)果類(lèi)似,HMGB1水平在ARDS患者血清中升高,且隨著水平的升高,病情嚴(yán)重程度逐漸加重,死亡組患者HMGB1水平高于生存組,相關(guān)性分析結(jié)果表明,HMGB1水平與APACHEⅡ評(píng)分呈正相關(guān),提示血清HMGB1水平有助于評(píng)估ARDS的病情發(fā)展和預(yù)后。

動(dòng)物模型研究證實(shí),miR-574-5p可以通過(guò)靶向HMGB1緩解ARDS,然而HMGB1的過(guò)表達(dá)能夠逆轉(zhuǎn)miR-574-5p的抗炎作用[16]。ARDS患者血清miR-574-5p水平與HMGB1呈正相關(guān),分析其原因,miR-574-5p水平升高可能為機(jī)體的代償性適應(yīng),但miR-574-5p對(duì)HMGB1的靶向抑制作用不及疾病誘發(fā)HMGB1表達(dá)的作用,進(jìn)而導(dǎo)致二者水平均升高,但二者也可能存在靶向關(guān)系。miR-574-5p和HMGB1被認(rèn)為是評(píng)估膿毒癥患者預(yù)后的獨(dú)立因素[17-18]。多因素Cox回歸分析表明,APACHEⅡ評(píng)分及miR-574-5p、HMGB1水平均為影響ARDS患者生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,提示血清miR-574-5p和HMGB1可能作為評(píng)估ARDS患者預(yù)后的分子標(biāo)志物,且二者呈正相關(guān),該結(jié)果可能為ARDS的治療提供新的見(jiàn)解。

綜上所述,ARDS患者血清miR-574-5p、HMGB1與ARDS的病情嚴(yán)重程度和預(yù)后密切相關(guān),具有作為新的治療靶點(diǎn)的潛力,對(duì)于臨床優(yōu)化治療和改善預(yù)后具有重要的意義。但本研究仍有缺陷,如miR-574-5p是否可通過(guò)靶向HMGB1影響ARDS的病情進(jìn)展仍不明確,需要在未來(lái)的研究中補(bǔ)充基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行說(shuō)明。