基于ITS 序列PCR-RFLP 鑒別大薊藥材及飲片中摻偽飛廉、魁薊的方法研究*

張詩華，賴晶，倪琳，宋平順，李辰荃，郭朝暉

（1.甘肅中醫藥大學藥學院，蘭州 730030；2.甘肅省藥品檢驗研究院，蘭州 730070）

大薊作為常用中藥材，2020 年版《中國藥典》一部中規定其為菊科植物薊（Cirsium japonicum Fisch.ex DC.）的干燥地上部分，具有涼血、止血，化瘀解毒、消癰的功效，在臨床上常用于衄血，吐血，尿血，便血，崩漏，外傷出血，癰腫瘡毒[1]。飛廉（Carduus crispus L.）是菊科飛廉屬二年生或多年生草本植物，收載于《衛生部藥品標準藏藥》第一冊，具催吐，常用于消化不良，培根病，瘡癤，癰疽等癥[2]。魁薊（Cirsium leo Nakai et Kitag.）是菊科薊屬植物，又名刺兒菜。大薊作為市場主流商品，在商品流通中常常被混淆。三者均為菊科植物，因親緣關系較近，性狀、顯微組織十分相似，化學成分的特異性不強，采用傳統的鑒別方法難以鑒別，現行標準中缺乏專屬性的檢驗方法。在中藥市場中可能會存在以飛廉、魁薊冒充大薊或摻入到大薊中進行買賣，這嚴重影響到臨床用藥安全。因此，建立一種將大薊、飛廉、魁薊等易混品種區分開的分子遺傳標記鑒別方法顯得尤為重要[3]。PCR-RFLP 即聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性，這種方法是在聚合酶鏈反應（PCR）的基礎上，對特異性片段進行切割，然后通過瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測，其具直觀、靈敏、重現性好、專屬性高等特點。近些年來，PCR-RFLP 運用于石斛[4]、川貝母[5]的鑒別研究，快速篩選高純合度天麻[6]，木香[7]、當歸[8]、羅布麻[9]、覆盆子[10]等中藥材的真偽鑒別中得到應用。但將PCR-RFLP 技術應用在大薊真偽鑒別方面的研究較少，因此亟需建立一種鑒別大薊及易混品的檢測方法。本研究利用PCRRFLP 技術，篩選出飛廉和魁薊的酶切位點，設計引物后對PCR-RFLP 方法優化，建立了鑒別大薊易混品飛廉、魁薊的專屬性檢測方法。

1 材料與儀器

1.1 材料 大薊對照藥材（批號：121411-201903）小薊對照藥材（批號：121436-201803）均購于中國食品藥品檢定研究院。本研究中的大薊、小薊、飛廉、魁薊、絲路薊、花葉滇苦菜樣品均由甘肅省藥品檢驗研究院宋平順主任藥師收集并鑒定。具體信息見表1。

表1 樣品來源信息表

1.2 試劑 Plant Genomic DNA Kit 2000 preps 植物DNA 提取試劑盒、2 ×Taq PCR MasterMix、D200 DNA Marker （天根生化科技北京有限公司）；2×Taq PCR StarMix（北京康潤生物科技有限公司）；2×Easy Taq PCR SuperMix （北京全式金生物技術股份有限公司）；瓊脂糖（Invitrogen 公司）；GelRed TM 核酸凝膠染料（Biotium 公司）；限制性內切酶ApalI、限制性內切酶ZraI（NEB 北京有限公司）。

1.3 儀器 5424 R 型高速冷凍離心機（德國艾本德公司）；Dry Block Heater 2 型恒溫金屬水浴鍋（德國艾卡公司）；VeritiTM 96-Well 型PCR 儀、Nano Drop one C 型微量核酸定量儀（美國賽默飛世爾科技有限公司）；Sub-cell GT 型瓊脂糖凝膠電泳儀（美國伯樂公司）；GelDoc-IT 315 凝膠成像系統（美國斯柏貿易北京有限公司）。

2 方法與結果

2.1 基因DNA 的提取 取藥材細粉30 mg 置于2 mL 離心管中，按照Plant Genomic DNA Kit 2000 preps 植物DNA 提取試劑盒說明書提取樣品的DNA（離心半徑13 cm），另取大薊對照藥材、小薊對照藥材各30 mg，同法制成對照藥材模板DNA 溶液。將提取好的DNA 模板于-20 ℃冰箱保存備用。

2.2 ITS 片段擴增與測序樣品 采用ITS 通用引物進行擴增，引物序列為ITS 2（F）：5’-ATGCGATACT TGGTGTGAAT-3’；ITS3（R）：5’-GACGCTTCTCCAG ACTACAAT-3’反應體系總體積為50 μL，其中包含2×Taq PCR MasterMix 25 μL，正反引物各1 μL，DNA 模板2 μL，用無菌水補足至50 μL。ITS 擴增反應條件為94 ℃預變性5 min，30 個循環（94 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s），72 ℃5 min。PCR 產物由上海生工有限公司進行雙向測序，以保證結果的有效性與準確性。

2.3 PCR-RFLP 引物設計 利用DNAMAN 軟件對測序得到的大薊、飛廉和魁薊ITS 序列進行比對，查找合適穩定的變異位點，篩選出飛廉的酶切位點（GACGTC CTGCAG），魁薊的酶切位點（GTGCAC CACGTG），通過Primer Premier 5.0 軟件設計含此酶切位點的鑒別引物3F-3R，送上海生工有限公司合成。引物序列為3F：5’-GGTGAACCTGCGGAAG-3’，3R：5’-GATGGTTCACGGGATTCT-3’。

2.4 瓊脂糖凝膠電泳 按照瓊脂糖凝膠電泳法（四部通則0541），膠濃度為1.5%，膠中加入核酸凝膠染色劑GelRed；供試品、對照藥材酶切反應溶液的上樣量分別為8 μL，DNA 分子量標記上樣量為5 μL（0.5 μg/μL）。電泳結束后，取凝膠片在凝膠成像儀上或紫外透射儀上檢視。

2.5 PCR 擴增條件的優化 分別選大薊、小薊、飛廉、魁薊、絲路薊、花葉滇苦菜一份樣品對特異性鑒別引物進行PCR 反應條件進行考察。

2.5.1 退火溫度考察 如圖1 所示，在退火溫度52、54、56 ℃時，樣品非特異性擴增明顯；退火溫度58、60 ℃時，樣品均在250～500 bp 范圍內檢測到單一DNA 條帶；退火溫度升至62 ℃時，樣品擴增率降低；為了保證良好的重復性，因此選用58～60 ℃作為退火溫度。

圖1 不同溫度PCR 擴增電泳圖

2.5.2 循環次數考察 如圖2 所示，當循環次數為25 時，樣品擴增率低；循環次數為35 時，樣品出現非特異性擴增，不利于PCR-RFLP 檢測，為保證擴增的穩定性，選用30 個循環。

圖2 不同循環數PCR 擴增電泳圖

2.5.3 不同DNA 聚合酶考察 如圖3 所示，不同類型的聚合酶均在250～500 bp 檢測出單一DNA 條帶，表明所建立的PCR 方法不受聚合酶類型的影響，本方法以2×Taq PCR MasterMix 聚合酶作為該方法PCR 反應的擴增酶。

圖3 不同DNA 聚合酶PCR 擴增電泳圖

綜上所述，PCR 反應總體積為25 μL，其中包括正反引物各0.5 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，DNA 模板1 μL，無菌水補足至25 μL。反應條件為94 ℃5 min，30 個循環（94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s），72 ℃5 min。

2.6 酶切體系條件優化 根據《中國藥典》2020 年版四部通則1001 聚合酶鏈式反應法4 測定法[11]中，反應產物檢測中酶切反應總體積一般為20 μL，加入PCR 擴增產物一般為5～10 μL，由此可見底物量不同也會影響酶切后的結果，因此考察了5、8 和10 μL 3 種不同的底物量。依據限制性內切酶種類選擇適宜反應溫度進行酶切，酶切反應時間通常為2～4 h，快速限制性內切酶的反應時間不超過1 h，所以同時對酶切時間也進行了考察。

2.6.1 ZraI 限制性內切酶酶切條件優化 如圖4AC 所示，酶切時間依次設置為60、90、120 min，飛廉均被ZraI 酶酶切成120 bp 和259 bp 兩條DNA 條帶，從酶切后兩條DNA 的亮度和清晰度判斷，酶切時間選為120 min。如圖4D-F 所示，當底物量為5 μL 時，底物量過低，影響結果判斷；隨著底物量的增大，酶切后的兩條帶DNA 條帶變亮，因此底物量選為8 μL。綜上所述，ZraI 限制性內切酶的酶切反應體系為：ZraI 酶0.5 μL、NEBuffer 2 μL、擴增產物8 μL，無菌水補足至20 μL；反應條件為：37 ℃酶切120 min。

圖4 ZraI 酶不同酶切時間及底物量電泳圖

2.6.2 ApaLI 限制性內切酶酶切條件優化 如圖5A-C 所示，酶切時間依次設置為30、60、90 min，魁薊均被ApaLI 酶酶切成126 bp 和253 bp 兩條DNA條帶，隨著酶切時間的增長，酶切后的兩條DNA 條帶變亮，考慮條帶的亮度和清晰度，酶切時間選為60 min。如圖5D-F 所示，當底物量為5 μL 時，底物過低，影響結果判斷；底物量為10 μL 時，底物過高，酶切效果不佳；當底物量選擇為8 μL 時，酶切效果最好。綜上所述，ApaLI 限制性內切酶反應體系：ApaLI 酶0.5 μL、NEBuffer 2 μL、擴增產物8 μL，無菌水補足至20 μL；酶切反應條件為：37 ℃酶切60 min。

圖5 ApalI 酶不同酶切時間和底物量電泳圖

2.7 適應性考察 對不同產地的大薊、飛廉、魁薊等藥材進行上述PCR-RFLP 反應鑒別。結果發現所有樣品均能擴增出一條379 bp 的DNA 條帶。飛廉均被ZraI 酶酶切成120 bp 和259 bp 兩條DNA 條帶（結果見圖6）；魁薊均被ApaLI 酶酶切成126 bp和253 bp 兩條DNA 條帶（結果見圖7）。由此可見該PCR-RFLP 方法可以對大薊的混偽品飛廉、魁薊進行快速鑒別。

圖6 飛廉適應性考察電泳圖

圖7 魁薊適應性考察電泳圖

2.8 摻偽比例考察 將易混品飛廉、魁薊分別依次按照0%、1%、3%、5%、10%、25%、50%、75%、100%的質量百分比比例摻入大薊藥材中，混合均勻后提取DNA，用PCR-RFLP 方法鑒別。摻入比例為0%的樣品，檢出一條379 bp 的DNA 條帶，均未檢出酶切后的兩條DNA 條帶；大薊中摻入1%飛廉時，檢出很淡的兩條DNA 條帶，但大薊中摻入3% 以上的飛廉時，所有樣品均檢出120 bp 和259 bp 兩條DNA 條帶（結果見圖8）。大薊中摻入1%魁薊時，也檢出很淡的兩條DNA 條帶，但大薊中摻入3% 以上的魁薊時，所有樣品均檢出126 bp 和253 bp 兩條DNA 條帶（結果見圖9）。酶切條帶的亮度與摻偽樣品含量呈正相關，說明摻偽樣品比例越高，酶切后條帶越顯著。

圖8 飛廉摻偽比例考察電泳結果圖

圖9 魁薊摻偽比例考察電泳結果圖

3 討論

目前對大薊、飛廉和魁薊的研究多集中在藥理藥效和化學成分方面，對物種基原的鑒別研究甚少。李治昊等[12]對大薊和魁薊的含量進行測定，結果發現大薊和魁薊中均能檢出蒙花苷和綠原酸。大薊和魁薊在藥用方面具有極大相似性。此外還有研究發現，飛廉和魁薊雖同屬菊科植物，但不具有上述功效，所以不能代替大薊藥用。大薊可抑制結核桿菌的生長[13]。萬成杰[14]采用實時熒光定量PCR 技術，研究大薊中單體化合物HP01 干預結核桿菌Kat G 基因的轉錄。張景景等[15]研究表明ITS2 序列可以作為鑒定大薊藥材及其近緣混偽品，但對于大薊中摻入飛廉或者魁薊并未有直接方法來鑒別。張峻銓等[16]對大薊進行RAPD 反應，采用SAS 統計分析軟件對樣品的PCR 結果進行了UPGMA（非加權類平均法）聚類分析表明，分子標記在薊柄銹菌的劃分與鑒定上具有很高的靈敏度與準確性。且來源地越靠近、孢子類型相同、采集時間越接近的樣品親緣關系越相近。

本實驗通過對大薊、飛廉和魁薊三者的ITS 序列對比分析，分別篩選出飛廉和魁薊的特異性限制性內切酶位點，設計PCR 擴增引物，建立了大薊混偽品飛廉和魁薊的PCR-RFLP 快速鑒別方法。同時進行了摻偽實驗，將不同比例的飛廉與魁薊分別摻入到大薊樣品中，該PCR-RFLP 方法可以檢測出摻入1%的混偽品飛廉和魁薊。因此本試驗建立的PCR-RFLP 方法穩定可行，專屬性強、操作簡單和反應靈敏等優點[5]，可作為鑒別日常大薊混偽品飛廉和魁薊的方法。

PCR-RFLP 方法雖已在生物鑒定中廣泛應用，但其在一定方面存在局限性，只是用目標序列進行體外循環，如序列有替換、單點突變或者缺失都可能會導致錯誤結論[17]。同時本試驗也存在一定局限性，例如樣本量較少，在今后的研究中可收集更多的樣本來驗證結論。