芹菜素7-O-葡萄糖苷對抗TRAIL乳腺癌細胞凋亡的作用機制研究*

張娜賢，劉柳，李剛，劉琳瑞，李元穎

（南陽市第二人民醫(yī)院乳腺腫瘤科，南陽 473000）

乳腺癌是上皮細胞增殖失控所致惡性病變，位居女性惡性腫瘤首位，早期癥狀表現(xiàn)為乳房腫塊和腋窩淋巴結(jié)腫大，晚期可出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移[1]。中國乳腺癌每年新增約30 萬人，目前乳腺癌主要以精準化綜合性治療為主，根據(jù)患者狀態(tài)給予局部和全身性治療[2-3]。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）是具有誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡的內(nèi)源性蛋白，但對正常細胞的毒性很小，被認為是一種潛在、較安全的抗癌劑，在惡性腫瘤治療和預(yù)防中有較好的運用前景[4-5]，但仍有部分惡性腫瘤細胞對TRAIL 所致細胞凋亡存在抗性。芹菜素7-O-葡萄糖苷（AGL）是具有抗炎、抗癌作用的黃酮類化合物[6]，可抑制宮頸癌細胞遷移[7]，但AGL 在乳腺癌作用機制尚不清楚。本研究旨在探討AGL 對抗TRAIL 誘導(dǎo)凋亡乳腺癌細胞的影響，希望為恢復(fù)抗TRAIL 乳腺癌細胞的TRAIL 敏感性提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人正常乳腺細胞MCF-10A（HZNC044，上海滬震實業(yè)有限公司），人乳腺癌細胞MB231、MCF-7（HT-X1647、HT-X1646，深圳市豪地華拓生物科技有限公司）。

1.1.2 實驗動物 SPF 級BALB/c 裸鼠，雌性，72 只，3～4 周齡，體質(zhì)量（13±1）g，購自南方醫(yī)科大學(xué)[許可證號，SCXK（粵）2016-0041]，飼養(yǎng)房環(huán)境為溫度20～25 ℃，空氣濕度50%～55%，人工光照12 h/d，飲水自由，進食自由。

1.1.3 試劑 AGL（ZT-23726，上海甄準生物科技有限公司，純度＞98%），N-乙酰基半胱氨酸（NAC）（A7250，美國SIGMA 公司，純度≥99%），Cas-3 抑制劑z-DEVD-fmk、Cas-9 抑制劑Z-LEHD-FMK（abs812077、abs813893，愛必信上海生物科技有限公司，純度：98%），Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒（40302ES20，上海翊圣生物科技有限公司），CCK8 試劑盒（40203ES76，上海翊圣生物科技有限公司），兔多抗Cleaved-Cas-9、Cleaved-Cas-3、p53上調(diào)凋亡調(diào)制物（PUMA） 抗體和兔抗人p53、Cleaved PARP -1、PARP -1 抗 體（ATA27024、ATA25877、ATA36082、ATA34929、ATA27078、ATA35118，武漢益普生物科技有限公司），ECL Kit（ECL-0013，美北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司），超氧化物歧化酶（SOD）Elisa 試劑盒（R-1298，上海廣銳生物科技有限公司），丙二醛（MDA）Elisa 試劑盒（CK-E10376，武漢益普生物科技有限公司）。

1.1.4 儀器 高速冷凍離心機（Avanti JXN-26，Beckman Coulter），熒光顯微鏡（DMi8-電動，奧地利徠卡），共聚焦顯微鏡（STELLARIS，德國徠卡公司）。

1.2 細胞培養(yǎng) MCF-10A 置于DMEM/F12 培養(yǎng)基（5%馬血清、10 μg/mL 胰島素、20 ng/mL 表皮生長因子、100 ng/mL 霍亂毒素、0.5 μg/mL 氫化可的松）37℃、5% CO2培養(yǎng)，MCF-7 細胞置于DMEM （10 %胎牛血清、1%丙酮酸鈉）37℃、5% CO2培養(yǎng)，MB231細胞置于含10% L15 培養(yǎng)基（10 %胎牛血清）37 ℃、無CO2培養(yǎng)[8]。當各組細胞生長至80%～90%時，進行傳代培養(yǎng)，選取第3 代細胞用于后續(xù)實驗。

1.3 體外實驗

1.3.1 CCK-8 檢測細胞活力 取對數(shù)生長期的MCF-10A、MCF-7、MB231 細胞種于96 孔培養(yǎng)板（1×105個/孔），同1.2 培養(yǎng)條件培養(yǎng)至過夜，待貼壁后更換培養(yǎng)基，加入不同作用試劑，使其最終濃度為TRAIL（0、5、10、20、50、100、200 ng/mL）、AGL（0、10、20、40、80 μmol/L）、NAC （4 mmol/L）、z-DEVDfmk（25 μmol/L）[9]、Z-LEHD-FMK（20 μmol/L）[10]，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，加入CCK-8（20 μL/孔），避光37 ℃孵育3 h，450 nm 波長檢測吸光度值，細胞存活=（實驗組吸光度值/對照組吸光度值）×100%。設(shè)置不做任何處理的細胞為Control 組，每種濃度分別設(shè)置5 個復(fù)孔，取均值作為該組結(jié)果。實驗重復(fù)3 次。

1.3.2 針對細胞凋亡的檢測 取對數(shù)生長期MCF-10A、MCF-7、MB231 細胞接種于6 孔培養(yǎng)板（1.5×105個/孔），藥物作用前培養(yǎng)方式同1.3.1，將細胞按如下分組：MCF -10A （20 μmol/L AGL +50 ng/mL TRAIL） 和MCF -7 （20 μmol/L AGL +50 ng/mL TRAIL）、MCF -7 [TRAIL（0、100 ng/mL）] 和MB231[TRAIL（0、100 ng/mL）]，給予藥物干預(yù)，培養(yǎng)24 h，收集細胞于3 000 r/min 離心5 min，PBS 洗滌2 遍，棄上清液，300 μL 1×Binding Buffer 緩沖液重懸細胞，加入5 μL Annex-inV/FITC 和10 μL PI 混合，室溫避光孵育20 min，流式細胞儀上樣，自帶軟件分析計算細胞凋亡率。復(fù)孔設(shè)置和實驗次數(shù)同1.3.1。

1.3.3 蛋白免疫印跡（Western-blot）檢測蛋白水平 收集1.3.1 中的細胞并提取總蛋白，Bradford 調(diào)整各組提取蛋白濃度一致，經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳、電轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜，密封2 h，加入兔抗人Cleaved-Cas-9、Cleaved-Cas-3、p53、PUMA、Cleaved PARP-1、PARP-1、β-actin 抗體（1∶500）4 ℃孵育過夜，TBST漂洗40 min，加入HRP 標記二抗（1∶500）孵育1 h，TBST 漂洗40 min，ECL 顯影，Image Lab 軟件分析目標蛋白相對灰度值。實驗重復(fù)3 次。

1.3.4 ROS 熒光檢測 取對數(shù)生長期MCF-10A 細胞接種于Petri 培養(yǎng)皿（1.0×1010 個），分別設(shè)置H2O2組（50 μmol/L）、TRAIL 組（0、50 ng/mL）、AGL 組（0、10、20 μmol/L）、NAC 組（4 mmol/L）、50 ng/mL TRAIL+20 μmol/L AGL 組、50 ng/mL TRAIL +20 μmol/L AGL+4 mmol/L NAC 組，培養(yǎng)方式同1.3.1，培養(yǎng)24 h，去培養(yǎng)基，PBS 漂洗2 次，加入10 μmol/L DCFDA無血清培養(yǎng)液2 mL，孵育20 min，棄培養(yǎng)基，PBS 漂洗2 次，加入1 mL PBS，用于共聚焦顯微鏡掃描檢測，λex=495 nm，λem=525 nm，ROS 熒光信號為綠色。實驗重復(fù)3 次。

1.3.5 MDA 水平和SOD 活性檢測 收集1.3.4 中H2O2組（50 μmol/L）、AGL 組（0、10、20 μmol/L）MCF-10A 細胞，3 500 r/min 離心10 min，取上清液備用，采用Elisa 檢測MDA 水平和SOD 活性。實驗重復(fù)3 次。

1.4 體內(nèi)實驗

1.4.1 移植瘤動物模型建立 將72 只雌性BALB/c裸鼠隨機均分為Control 組和AGL+TRAIL 組，將MCF-10A 細胞皮下注射（5.0×107個）裸鼠右前肢腋，次日，AGL+TRAIL 組腹腔注射AGL[25 mg/（kg·d）][11]和200 μL TRAIL（1 μg/mL）[12]，Control 組給予等體積生理鹽水，每隔5 d，各組隨機選取5 只小鼠分離移植瘤并測量腫瘤體積變化。30 d 后，麻醉處死所有小鼠并分離移植瘤，測定移植瘤重量，4%中性甲醛溶液固定移植瘤，用于TUNEL 檢測和p53、PUMA免疫組化。

1.4.2 TUNEL 檢測 移植瘤常規(guī)石蠟包埋、切片（4 μm）、脫蠟，蛋白酶K 修復(fù)20 min，3% H2O2室溫5 min，PBS 洗2 次，TdT 酶于37 ℃作用60 min，PBS洗3 次，氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作溶液作用30 min，PBS 洗4 次，0.05% DAB 顯色4 min，蒸餾水洗4 次，蘇木精復(fù)染10 min，蒸餾水洗3 次，脫水，透明，封片。細胞核棕黃色或棕褐色顆粒為凋亡陽性細胞，每張片子選取5 個視野，記錄陽性細胞數(shù)，計算細胞凋亡率=（陽性細胞數(shù)目）/（總細胞數(shù)目）×100%。

1.4.3 免疫組化 移植瘤固定至切片步驟同1.4.2，PBS 溶液漂洗、3%H2O2與甲醇混合液浸泡10 min，超純水漂洗、抗原修復(fù)、PBS 漂洗5 min、加入p53、PUMA 一抗37 ℃反應(yīng)2h、PBS 漂洗5 min、加入二抗37 ℃反應(yīng)40 min、PBS 漂洗5 min、DAB 室溫顯色30 min，鏡檢觀察有棕黃色顆粒出現(xiàn)時自來水終止，蘇木素復(fù)染30 s，后續(xù)步驟同1.4.2。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，GraphPad Prism 6.0 軟件繪制柱狀圖，符合正態(tài)分布且方差劑性數(shù)據(jù)均以均值±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗，P<0.05 表示存在統(tǒng)計差異。

2 結(jié)果

2.1 TRAIL 對乳腺癌細胞存活及凋亡的影響 為篩選出抗TRAIL 乳腺癌細胞株，對MB231 細胞株、MCF7 細胞株進行TRAIL 濃度梯度實驗，采用CCK-8 法、流式法檢測細胞存活率和細胞凋亡率，結(jié)果顯示TRAIL 作用濃度為50、100、200 ng/mL時，MB231 細胞存活率顯著降低且Cleaved PARP-1水平顯著升高（P<0.05），MCF7 細胞存活率變化無統(tǒng)計差異且無Cleaved PARP-1 表達（P>0.05）（圖1A、B）；TRAIL（100 ng/mL）作用下，TMCF7 細胞細胞凋亡率無明顯變化（P>0.05），MB231 細胞凋亡率升高（P<0.05）（圖1C、D），說明MCF7 細胞對TRAIL作用不敏感，對TRAIL 存在抗性。

2.2 AGL 和TRAIL 協(xié)同促進MCF7 細胞凋亡 為探究AGL 聯(lián)合TRAIL 作用對抗TRAIL 性MCF7 細胞凋亡的影響，進行AGL 濃度梯度處理，篩選出無細胞毒性AGL 濃度與TRAIL 聯(lián)合作用MCF7 細胞，觀察細胞凋亡和Cleaved PARP-1 蛋白表達情況，結(jié)果顯示AGL 作用濃度為40、80 μmol/L 時，MCF7 細胞存活率顯著低于Control（P<0.05）；TRAIL（50 ng/mL）增加AGL（20、40 μmol/L）處理時，MCF7細胞存活率顯著低于TRAIL（50ng/mL）處理（P<0.05），Cleaved PARP-1 水平顯著高于TRAIL（50 ng/mL）處理（P<0.05）（圖2A-C）。AGL （20 μmol/L）+TRAIL（50 ng/mL）處理時，MCF7 細胞凋亡率顯著高于AGL（20 μmol/L）處理（P<0.05），而MCF-10A 細胞與AGL（20 μmol/L）處理差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）（圖2D、E），說明AGL 聯(lián)合TRAIL 可能通過提高Cleaved PARP-1 蛋白表達促進MCF7 細胞凋亡。

圖2 AGL 和TRAIL 協(xié)同促進MCF7 細胞凋亡

2.3 AGL 聯(lián)合TRAIL 處理對Caspases 信號級聯(lián)的影響 在AGL 聯(lián)合TRAIL 處理基礎(chǔ)上增加Caspases信號級聯(lián)相關(guān)蛋白酶抑制劑，為探究AGL 聯(lián)合TRAIL 作用促進MCF7 細胞凋亡的作用機制，結(jié)果顯示TRAIL（50 ng/mL）、AGL（20 μmol/L）作用24 h時，MCF7 細胞均未檢測出Cleaved PARP-1、Cleaved-Cas-3、Cleaved-Cas-9 表達；TRAIL（50 ng/mL）+AGL（20 μmol/L） 作用8 h、16 h 和24 h 時，MCF7 細胞Cleaved PARP-1、Cleaved-Cas-3、Cleaved-Cas-9 水平顯著高于Control （P<0.05）；TRAIL （50 ng/mL）+AGL （20 μmol/L） 作用4 h 時，MCF7 細胞Cleaved PARP-1 水平顯著高于Control （P<0.05）（圖3A）。TRAIL（50 ng/mL）分別聯(lián)合AGL（10、20、40 μmol/L）作用24 h 時，MCF7 細胞Cleaved-Cas-3、Cleaved-Cas-9 水平顯著高于TRAIL（50 ng/mL）處理（P<0.05）（圖3B）。TRAIL（50 ng/mL）+AGL（20 μmol/L）作用24 h 時，MCF7 細胞存活率顯著低于Control（P<0.01），而Cleaved PARP-1 相對蛋白水平顯著高于Control（P <0.01）；TRAIL（50 ng/mL）+AGL（20 μmol/L）+Cas-3 inhibitor、TRAIL（50 ng/mL）+AGL（20 μmol/L）+Cas-9 inhibitor 作用24 h 時，MCF7 細胞存活率與Control 比較無統(tǒng)計差異（P>0.05），且均未檢測出Cleaved PARP-1 表達（圖3C、D），說明AGL 聯(lián)合TRAIL 處理可能通過促進Cleaved PARP-1、Cleaved-Cas-3、Cleaved-Cas-9 蛋白表達激活Caspases 信號級聯(lián)反應(yīng)，從而降低MCF7 細胞存活率。

圖3 AGL 聯(lián)合TRAIL 處理對Caspases 信號級聯(lián)的影響

2.4 AGL 對MCF7 細胞活性氧產(chǎn)生的影響 進行AGL、TRAIL、AGL+TRAIL、H2O2、NAC、AGL+TRAIL+NAC 處理MCF7 細胞為探究AGL 聯(lián)合TRAIL 處理促進MCF7 凋亡是否與細胞活性氧產(chǎn)生有關(guān)，結(jié)果顯示AGL（10、20 μmol/L）、H2O2（50 μmol/L）處理下的MCF7 細胞ROS（+）細胞數(shù)、MDA 水平顯著高于Control（P<0.05），而SOD 活性顯著低于Control（P<0.05）（圖4A-C）。TRAIL（50 ng/mL）、AGL（20 μmol/L）處理下的MCF7 細胞ROS（+）細胞數(shù)顯著高于Control（P<0.05），而NAC（4 mmol/L）處理下的MCF7細胞ROS （+） 細胞數(shù)顯著低于Control （P<0.05）；TRAIL（50 ng/mL）+AGL（20 μmol/L）處理下MCF7細胞ROS（+）細胞數(shù)、p53、PUMA、Cleaved PARP-1相對蛋白水平顯著高于TRAIL（50 ng/mL）處理（P<0.05），而細胞存活率顯著低于TRAIL（50 ng/mL）處理（P<0.05）；TRAIL（50 ng/mL）+AGL（20 μmol/L）+NAC（4 mmol/L）處理下MCF7 細胞ROS（+）細胞數(shù)、p53、PUMA、Cleaved PARP-1 相對蛋白水平顯著低于TRAIL（50 ng/mL）+AGL（20 μmol/L）處理（P <0.05）（圖4D-F），說明AGL 聯(lián)合TRAIL 可能是通過增加MCF7 細胞活性氧產(chǎn)生和p53、PUMA、Cleaved PARP-1 表達上調(diào)，加重細胞氧化應(yīng)激損傷，從而促進MCF7 細胞死亡。

2.5 AGL 聯(lián)合TRAIL 對小鼠乳腺癌原位移植瘤生長的影響 為探究AGL 聯(lián)合TRAI 對體內(nèi)腫瘤生長的影響，建立裸鼠移植瘤模型，結(jié)果顯示AGL+TRAIL 組小鼠乳腺癌原位移植瘤重量、體積、p53 陽性率、PUMA3 陽性率均顯著低于Control（P<0.05），腫瘤組織細胞凋亡率顯著高于Control（P<0.05）（圖5），說明AGL 聯(lián)合TRAIL 處理可抑制小鼠乳腺癌原位移植瘤生長。

圖5 AGL 聯(lián)合TRAIL 對小鼠乳腺癌原位移植瘤生長的影響

3 討論

TRAIL 是由281AA 編碼形成的Ⅱ型跨膜蛋白，可通過與死亡受體結(jié)合選擇性誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[13]，已有研究表明：多種腫瘤細胞對TRAIL 呈現(xiàn)出抗性，其作用機制尚未完全闡明，但普遍認為與死亡受體、線粒體、PI3/AKt 信號通路和MAP 激酶通路等有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)人MCF7 細胞和MB231 細胞對TRAIL 敏感性存在明顯差異，MB231細胞在TRAI 適宜濃度處理下細胞存活率顯著降低，而細胞凋亡率和Cleaved PARP-1 水平明顯升高，但MCF7 細胞無上述相似趨勢，說明MCF7 細胞對TRAIL 作用存在抗性。

克服TRAIL 耐藥性腫瘤細胞重點是如何恢復(fù)腫瘤細胞對TRAIL 的敏感性，單一使用TRAIL 或其他致敏劑對腫瘤細胞的滅殺效果較低，而TRAIL聯(lián)合致敏劑使用可增加其對腫瘤細胞的滅殺效果，例如多酚致敏劑。AGL 是一種穩(wěn)定的天然黃酮物質(zhì)，相比于其他芹菜素物質(zhì)具有更好的溶解性，還能夠抑制癌細胞、真菌生長，在細胞內(nèi)、外均可促進活性氧生成，誘導(dǎo)細胞質(zhì)膜損傷。本研究發(fā)現(xiàn)AGL一定濃度時可以顯著抑制MCF7 細胞生長，并且以非細胞毒性劑量AGL（20 μmol/L）聯(lián)合TRAIL（50 ng/mL）處理可以顯著提高MCF7 細胞凋亡率和Cleaved PARP-1 水平，但是對正常乳腺上皮細胞MCF-10A 無毒性影響。有研究認為AGL 比芹菜素具有更強的生物活性，在低濃度時就能促進結(jié)腸癌HCT116 細胞內(nèi)出現(xiàn)染色質(zhì)濃縮、凋亡小體形成和凋亡相關(guān)基因表達，具有細胞毒性作用。本研究結(jié)果趨勢也和上述前人研究趨勢相似，說明AGL（20 μmol/L）聯(lián)合TRAIL（50 ng/mL）能協(xié)同促進MCF7 細胞凋亡。

本研究發(fā)現(xiàn)AGL 聯(lián)合TRAIL 處理可促進MCF7細胞Cleaved PARP-1、Cleaved-Cas -3、Cleaved -Cas-9 升高，而在兩者聯(lián)合作用的基礎(chǔ)上增加Cas-3 抑制劑、Cas-9 抑制劑能夠逆轉(zhuǎn)Cleaved PARP-1水平上升。Caspases 參與細胞生長、分化、凋亡等過程，一般情況下Caspases 是以非活性酶原分布在細胞質(zhì)中，接收凋亡信號刺激后，形成催化活性的Caspases，Cas-3、Cas-9 在Caspases 級聯(lián)細胞凋亡反應(yīng)中占據(jù)重要作用。PARP-1 是細胞核酶，能夠催化聚二磷酸腺苷核糖化，參與DNA 損傷及修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和細胞死亡等過程。細胞凋亡主要有Caspases依賴途徑和Caspases 非依賴途徑，Caspases 可裂解PARP-1，PARP-1 裂解功能喪失是細胞凋亡順利進展的保證，本研究結(jié)果說明AGL 聯(lián)合TRAIL 處理促進MCF7 細胞凋亡與增強Caspases 信號級聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)AGL 聯(lián)合TRAIL 處理能促進MCF7 細胞內(nèi)ROS 水平和p53、PUMA 蛋白表達上調(diào)，而在此基礎(chǔ)上增加NAC 可降低ROS 水平和p53、PUMA 蛋白表達。ROS 是細胞的代謝產(chǎn)物，可在線粒體電子傳遞鏈中產(chǎn)生，線粒體ROS 水平異常升高可誘導(dǎo)線粒體膜出現(xiàn)去極化，改變線粒體膜結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，促凋亡因子進入胞基質(zhì)誘導(dǎo)凋亡，線粒體介導(dǎo)的細胞凋亡途徑也屬于Caspases 依賴途徑之一。p53 是細胞凋亡的重要調(diào)節(jié)因子，當細胞受致癌因子刺激時，p53 能抑制細胞周期運行并參與細胞凋亡進程。PUMA 能夠被p53 快速誘導(dǎo)表達，其翻譯蛋白是Bcl-2 同源家族成員，可解除Bcl-2 的抗凋亡作用，促進細胞凋亡。本研究結(jié)果說明AGL 聯(lián)合TRAIL 促進MCF7 細胞Caspases 信號級聯(lián)反應(yīng)可能與增強細胞內(nèi)ROS 含量和p53、PUMA 蛋白表達有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)AGL 聯(lián)合TRAIL 處理可抑制小鼠體內(nèi)移植瘤生長、促進移植瘤組織細胞凋亡，但沒有提高腫瘤組織p53、PUMA 表達，可能是因為體內(nèi)自身存在一套完善的免疫體系，參與移植瘤的生長調(diào)節(jié)過程，其中的具體作用機理還需要進一步探究。

綜上所述，MCF7 細胞對TRAIL 誘導(dǎo)的細胞凋亡存在抗性，在TRAIL 處理基礎(chǔ)上增加非細胞致毒劑量AGL 可提高細胞內(nèi)ROS 水平和MDA 含量，加重氧化應(yīng)激損傷，還能激活Caspase 級聯(lián)反應(yīng)，加快PARP-1 裂解，上調(diào)p53、PUMA 表達，降低MCF7 細胞對TRAIL 的抗性，從而促進MCF7 細胞凋亡。雖然體內(nèi)研究也證實AGL 聯(lián)合TRAIL 處理可降低移植瘤細胞生長，但其作用機制還需深入研究。