米口袋染色體制片技術優化及其核型分析

李玉萍 歐香 苗淑杏 朱士農

李玉萍，歐香，苗淑杏，等.米口袋染色體制片技術優化及其核型分析[J].福建農業科技，2023，54（8）：40-44

摘?要：以米口袋根尖為供試材料，用常規壓片法探討不同預處理方法和預處理時間對染色體制片的影響，優化染色體制片技術，并對其進行染色體核型分析，旨在為米口袋的分類、種質資源保存和利用及育種提供細胞學依據。結果表明：（1）當預處理時間為3 h時，0.1%秋水仙素溶液預處理效果最好；當預處理時間為6 h時，0.01%秋水仙素溶液預處理效果最好。得到的分裂相多，染色體濃縮程度適宜，分散性較好，形態清晰；（2）米口袋體細胞染色體數目為2n=2x=14，為二倍體植物。核型公式K（2n）=2x=14=10m+4sm，具中部著絲點染色體（m）的為第1、2、3、4、7對染色體，具近中部著絲點染色體（sm）的為第4、5對染色體。染色體相對長度組成為2n=14=2L+8M2+ 4M1，染色體長度比1.30，沒有臂比大于2的染色體，屬“1A”類型，為對稱型核型，說明米口袋在進化上屬于比較原始的類型。

關鍵詞：米口袋；染色體；核型分析；制片技術

中圖分類號：R 284.2???文獻標志碼：A???文章編號：0253-2301（2023）08-0040-05

DOI：10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.08.006

Optimization of the Chromosome Production Technology of Gueldenstaedtia vernaand Its Karyotype Analysis

LI Yu-ping， OU Xiang， MIAO Shu-xing， ZHU Shi-nong*

（College of Horticulture & Landscape， Jinling Institute of Technology， Nanjing， Jiangsu 210038， China）

Abstract：The effects of different pretreatment methods and pretreatment time on the chromosome production were explored by using the conventional tabletting method with Gueldenstaedtia verna as the tested material， in order to optimize the chromosome production technology. And the chromosome karyotype analysis was carried out to provide the cytological basis for the classification of Gueldenstaedtia verna， the preservation & utilization of germplasm resources and its breeding. The results showed that： （1） When the pretreatment time was 3 h， the pretreatment effect of 0.1% colchicine solution was the best， while when the pretreatment time was 6 h， the pretreatment effect of 0.01% colchicine solution was the best. There were many division phases， the degree of chromosome condensation was suitable， the dispersion was better， and the morphology was clear. （2） The chromosome number of somatic cells of Gueldenstaedtia verna was 2n=2x=14， which was a diploid plant. The karyotype formula was K（2n）=2x=14=10m+4sm. The chromosomes with the metacentric chromosome （m） were the 1st， 2nd， 3rd， 4th and 7th pairs of chromosomes， and the chromosomes with the submetacentric chromosome （sm） were the 4th and 5th pairs of chromosomes. The composition of the relative length of chromosome was 2n=14=2L+8M2+4M1， the length ratio of chromosome was 1.30， and there were no chromosomes with the arm ratios greater than 2， which belonged to the ″1A″ type and was a symmetrical karyotype， indicating that the Gueldenstaedtia verna was a relatively original type in the evolution.

Key words：Gueldenstaedtia verna； Chromosome； Karyotype analysis； Production technology

米口袋Gueldenstaedtia verna（Georgi）Boriss.又名米布袋、地丁、大米口袋，為豆科Leguminosae米口袋屬Gueldenstaedtia多年生草本植物。米口袋屬植物約有20種，分布于中亞和亞洲東部，中國有15種，主要分布在東北、華東、華北、陜西中南部、甘肅東部等地區。米口袋植株矮小，全株被白色長柔毛；分莖極縮短，葉和總花梗叢生其上；單數羽狀復葉，小葉呈橢圓形或長圓形，灰綠色；傘形花序有2～6朵花，花冠蝶形，紫色。莢果圓筒狀，棕色；種子多數，三角狀腎形，小如米粒，因此得名。花期4月，果期5月至6月。米口袋全草及根可入藥，能清熱解毒、消腫散結；地上部分可食用，營養價值高于白菜等蔬菜，有重要的開發利用價值。米口袋喜冷涼濕潤的氣候，耐寒、耐旱、耐貧瘠，具有較強的抗性。目前對米口袋屬植物的研究主要集中在種名考證及其分布、化學成分的種類和含量及其藥理作用、生態習性及園林應用、電鏡掃描花粉形態觀察等方面，有關染色體的核型分析卻是鮮有報道，而核型分析可為植物區系起源和進化提供重要依據，同時有利于探索植物系統發育過程中屬種之間的親緣和進化關系。本試驗擬從細胞學水平出發，采用染色體常規壓片技術對江蘇省南京市野生米口袋進行核型分析，以期為我國米口袋屬植物的分類及種間親緣關系、種質資源鑒定提供細胞遺傳學基礎和依據。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

以金陵科技學院幕府校區綠地野生的米口袋種子為試驗材料，于2020年6月至7月間采摘自然成熟的種子在通風的實驗室內陰干，然后貯藏在4℃的冰箱中備用。

1.2?試驗方法

1.2.1?根尖培養?2020年12月選取成熟飽滿的米口袋種子，用水浸泡44 h（每隔8 h換1次水），使其充分吸水，然后將種子轉入平鋪有濾紙的培養皿中，加入適量清水，蓋上皿蓋后置于25℃的恒溫箱內，每天澆水以保持種子正常的生命活動。待根長至1～2 cm時，于上午9：0～10：00剪取根尖0.5～1.0 cm。

1.2.2?預處理及固定?剪取的根尖，用蒸餾水清洗干凈，吸水紙吸去水分，置于小玻璃瓶中，然后向瓶中滴加適量預處理液。預處理液分別為：0.001mol·L 8-羥基喹啉、0.002 mol·L 8-羥基喹啉、0.01% 秋水仙素和0.1% 秋水仙素。然后于4℃冰箱分別處理3 h和6 h。以不做任何預處理直接在4℃冰箱固定做對照。將經過預處理的根尖，用蒸餾水清洗3～4次，用卡諾固定液在4℃冰箱中固定24 h，然后用蒸餾水清洗3～4次后轉入70%酒精中，于4℃冰箱中保存備用。

1.2.3?解離與染色?將冰箱內保存的根尖用蒸餾水清洗3～4次，用1 mol·L的HCl在60℃的恒溫水浴鍋中解離8 min。將解離后的根尖用蒸餾水清洗3～4次，置于干凈的載玻片上，滴加1～2滴卡寶品紅溶液，染色2 min。

1.2.4?壓片與鏡檢?蓋上蓋玻片，然后用濾紙包住玻片吸取多余染色液，用大拇指在上面施加少量壓力，勿使蓋玻片移動，用鉛筆輕敲，使細胞舒展，染色體散開。用Nikon DS-Ri2光學顯微鏡進行鏡檢。

1.2.5?數據分析?參照李懋學等植物核型分析的標準，染色體數目以體細胞染色體數目為主，要求統計的細胞數目在30個以上，其中85%以上的細胞具有恒定一致的染色體數，即可認為是該植物的染色體數目。因此，本試驗選取50個染色體分散良好、收縮適宜的中期分裂相細胞進行觀察和分析，統計各個細胞染色體數目，從而得出米口袋染色體數目。選擇5個染色體分散良好、收縮適宜且形態清晰的中期分裂相細胞，分別測量各個細胞的染色體長臂長度、短臂長度及染色體總長度，并取其平均值。

以測量和計算得到的各項參數為基礎，利用Adobe Photoshop 6.0圖像處理軟件對染色體進行復制剪貼、排列和同源染色體配對等分析，并將配對好的同源染色體按從長到短的順序依次從左往右排列，并依次命名。染色體類型采用Levan、孫浩男等的方法，核型不對稱性按Stebbins的分類標準。

2?結果與分析

2.1?米口袋染色體制片的優化

由圖1、表1可知，不同預處理方法及預處理時間，米口袋根尖染色體制片的效果不同。當預處理時間為3 h時，0.1%秋水仙素溶液預處理效果最好，得到的分裂相多，染色體濃縮程度適宜，分散性較好，形態清晰；當預處理時間為6 h時，0.01%秋水仙素溶液預處理效果最好，得到的分裂相多，染色體濃縮程度適宜，分散性較好，形態清晰。

2.2?米口袋染色體核型分析

2.2.1?染色體數目?選取米口袋根尖分生組織細胞分裂相中染色體分散較好的細胞50個觀察并統計，結果顯示：米口袋染色體數目在12～16條，其中有44個細胞染色體數目為14條，占計數細胞的90%，4個細胞染色體為12條，占計數細胞的8%，2個細胞染色體為16條，占計數細胞的4%。根據李懋學等的標準，確定米口袋體細胞染色體數目為2n=14（圖2）。

2.2.2?染色體形態?根據圖2、圖3和表2可知，米口袋體細胞染色體數目為2n=14，共7對染色體，為二倍體植物。米口袋核型公式為K（2n）=2x=14=10m+4sm，具中部著絲點染色體（m）的為第1、2、3、4、7對染色體，具近中部著絲點染色體（sm）的為第4、5對染色體。最長染色體為0.48 μm，最短染色體為0.37 μm，染色體長度變化在0.48～0.37 μm，最長染色體是最短染色體的1.30倍。相對長度變異范圍為13.60～17.91，染色體相對長度組成為2n=14=2L+8M2+4M1。染色體長度比1.30，沒有臂比大于2的染色體，屬“1A”類型，核型對稱性明顯。

3?結論與討論

本試驗從優化染色體制片技術幵始，探索米口袋染色體核型特征，為該屬植物及該區域植物的研究提供細胞學依據。植物染色體核型研究的首要環節是染色體制片技術，因而制片技術的好壞直接影響核型分析的成功與否。良好的染色體制片受多種因素影響，其中合適的預處理液及其濃度和處理時間是制片的關鍵，對染色體制片的質量至關重要。預處理效果好，不僅可以獲得較多的處于中期分裂相的染色體，而且可以使染色體分散開，有助于核型分析。因此，在試驗過程中應該特別注意預處理的方法。本研究結果顯示當預處理時間為3 h時，0.1%秋水仙素溶液預處理效果最好；當預處理時間為6 h時，0.01%秋水仙素溶液預處理效果最好。得到的中期分裂相多，染色體濃縮程度適宜，分散性較好，形態結構清晰，有助于米口袋染色體核型分析。

染色體核型對細胞遺傳學和細胞分類學具有重要的意義，為植物分類及種間親緣關系、種質資源鑒定提供細胞遺傳學基礎和依據。本研究從細胞學水平出發，采用染色體常規壓片技術對江蘇省南京市野生米口袋進行核型分析。結果表明，米口袋的染色體數目為14條，與楊德奎的研究結果一致。但米口袋染色體核型公式及染色體相對長度組成有別于本研究結果，楊德奎的研究結果顯示，米口袋核型公式為K（2n）=2x=14=14m，染色體相對長度組成為2n=14=6M2+8M1；而本試驗的研究表明，米口袋核型公式為K（2n）=2x=14=10m+4sm，染色體相對長度組成為2n=14=2L+8M2+4M1，造成這種差異的原因可能是試驗材料來源不同。本研究表明米口袋屬“1A”類型，核型對稱性明顯，說明其進化程度較低。

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（責任編輯：柯文輝）

收稿日期：2023-07-20

作者簡介：李玉萍，女，1976年生，博士，副教授，主要從事園林植物遺傳育種和應用研究。

*通信作者：朱士農，男，1963年生，博士，教授，主要從事園藝植物栽培、新品種選育的研究（E-mail：zsn@ jit.edu.cn）。

基金項目：南京市綠化園林局科技項目（YLKJ202111JH）。