大腸桿菌過表達EutJ、EutG對慶大霉素的耐藥性分析

翁嘉儀 俞丹丹 張裕丹 高媛媛

翁嘉儀，俞丹丹，張裕丹，等.大腸桿菌過表達EutJ、EutG對慶大霉素的耐藥性分析[J].福建農業科技，2023，54（9）：69-74.

收稿日期：2023-07-20

作者簡介：翁嘉儀，女，1999年生，碩士研究生，主要從事細菌耐藥研究。

*通信作者：高媛媛，女，1979年生，博士，副教授，主要從事細菌耐藥機理及防治技術研究（E-mail：541175559@qq.com）。

基金項目：福建省自然科學基金面上項目（2020J01175）。

摘? 要：為篩選新的耐藥關鍵基因并研究其耐藥機制以緩解細菌耐藥難題。通過構建乙醇胺利用伴侶蛋白EutJ、醇脫氫酶EutG過表達菌株，對兩株菌進行慶大霉素殺傷測試，以攜帶空質粒對數期野生型大腸桿菌的殺傷效果作為對照，進一步測定其最小抑菌濃度（MIC），并通過抑菌圈檢測抗生素攝取等方法，對乙醇胺代謝與細菌耐受的關聯進行研究。結果表明：過表達EutJ、EutG后大腸桿菌能通過降低菌體內抗生素濃度，以提高在慶大霉素殺傷條件下的存活率，證明eutJ、eutG基因可作為幫助細菌逃逸抗生素攻擊的潛在耐受相關基因。因此，乙醇胺代謝關鍵酶EutJ、EutG有望成為免疫佐劑或新型抗生素研發的作用靶標。

關鍵詞：乙醇胺利用伴侶蛋白EutJ；醇脫氫酶EutG；慶大霉素；耐藥性

中圖分類號：Q 93??? 文獻標志碼：A??? 文章編號：0253-2301（2023）09-0069-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.09.011

Drug Resistance Analysis of the Overexpression of EutJ and EutG to Gentamicin

WENG Jia-yi， YU Dan-dan， ZHANG Yu-dan， GAO Yuan-yuan*

（Fujian University Key Laboratory of Cellular Stress Response and Metabolic Regulation/

College of Life Science， Fujian Normal University， Fuzhou， Fujian 350108， China）

Abstract： In order to screen the new drug-resistant key genes and study their drug resistance mechanisms to alleviate the problem of bacterial resistance， by constructing the overexpression strains of the ethanolamine-utilizing chaperone protein EutJ and the alcohol dehydrogenase EutG， the killing tests of gentamicin were performed on the two strains. Then， by taking the killing effect of the wild-type Escherichia coli carrying the empty plasmid in logarithmic phase as the control group， the minimum inhibitory concentration （MIC） was further determined， and the correlation between the ethanolamine metabolism and bacterial tolerance was studied through the detection of antibiotic uptake by inhibition zone. The results showed that after the overexpression of EutJ and EutG， Escherichia coli could reduce the concentrations of antibiotics in the bacteria to improve the survival rate under the condition of gentamicin killing， which proved that the genes of eutJ and eutG could be used as the potential tolerance-related genes to help the bacteria escape from the antibiotic attacks. Therefore， the key enzymes of ethanolamine metabolism， EutJ and EutG， were expected to be the targets for the development of immune adjuvants or new antibiotics.

Key words： Ethanolamine-utilizing chaperone protein EutJ； Alcohol dehydrogenase EutG； Gentamicin； Drug resistance

自1966年慶大霉素（Gentamicin）被我國王岳教授首次從小單孢菌中分離后，便廣泛用于臨床和獸醫治療[1]。慶大霉素屬于氨基糖苷類抗生素，具有廣譜抗菌性和速效殺菌性[2]，但由于長期的不合理使用，導致耐藥細菌（Antibiotic-resistant bacteria）的大量出現，這讓慶大霉素的利用效率大大降低[3-4]。現已發現的耐藥細菌有耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）[5]、耐萬古霉素腸球菌（VRE）[6]、耐碳青霉烯鮑曼不動桿菌[7]、多重耐藥銅綠假單胞菌[8]和多重耐藥的大腸桿菌[9]。為緩解日益嚴重的細菌耐藥問題，不僅需要研制能夠應對的抗生素藥物，同時還應篩選更多潛在的藥物靶點[10-11]。已有研究發現涉及許多偶聯反應的代謝途徑是多重靶向抗生素的理想靶標，例如參與類異戊二烯生物合成及催化甾醇和大腸桿菌細胞壁生物合成后期階段的酶是甲氧西林和萬古霉素等抗生素的靶標[12]。乙醇胺（Ethanolamine， EA）以磷脂酰乙醇胺的形式存在，是大腸桿菌細胞膜的基本成分，同時作為重要的碳氮替代來源[13]。而乙醇胺利用伴侶蛋白EutJ、醇脫氫酶EutG在乙醇胺代謝中發揮著不可缺少的作用[14-17]，因此推測其可作為大腸桿菌新耐藥靶點。目前對EutJ、EutG與抗生素耐藥性的研究較少，也未有證據表明這兩種蛋白與細菌耐受性有直接關系，但有研究認為EutG活性對工程菌株中異丁醛向異丁醇的轉化有關，并參與自然環境中四環素的降解[18-19]。

為探討乙醇胺代謝與細菌耐藥的關聯問題，本研究通過使用pCA24N表達載體構建大腸桿菌乙醇胺代謝相關蛋白過表達菌株BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG），并與攜帶pCA24N空質粒的野生型大腸桿菌進行慶大霉素殺傷情況比較，以測試過表達EutJ、EutG菌株對慶大霉素耐受性的影響，經過測定最小抑菌濃度排除其為耐藥菌后，進一步利用抑菌圈檢測抗生素攝取方法檢測EutJ、EutG過表達菌株的胞內抗生素濃度，以便深入了解乙醇胺代謝相關蛋白EutJ、EutG對大腸桿菌慶大霉素耐藥性的影響，并挖掘了EutJ、EutG蛋白在細菌耐藥方面的新功能，希望為研制抗生素基因抑制型佐劑提供有效的靶點。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

1.1.1? 菌株與質粒? 本試驗所用菌株為實驗室保藏野生型大腸桿菌BW25113，質粒載體為pCA24N。

1.1.2? 試驗儀器與試劑? 試驗儀器：超低溫冰箱（-80℃）、恒溫水平震蕩搖床、凝膠瓊脂電泳儀、SDS-PAGE電泳儀、凝膠成像儀、恒溫培養箱（37℃）、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、震蕩渦旋儀、金屬浴。試劑：慶大霉素（25 mg·mL-1）由ddH2O配置而成，氯霉素（35 mg·mL-1）用分析乙醇配制而成。以上抗生素儲液均用0.22 μm濾膜過濾除菌后備用。考馬斯亮藍R250染料，6×Loading Buffer， 10% SDS，洗脫液。0.01 mol·L-1 PBS緩沖液（每1 L包含NaCl 8 g、KCl 0.2 g、Na2HPO4 1.42 g、KH2PO4 0.27 g）經過高溫高壓滅菌后使用，100 mg·mL-1溶菌酶用0.22 μm濾膜過濾除菌后備用。

1.1.3? 培養基? LB培養基：每1 L包含氯化鈉10 g、酵母粉5 g、蛋白胨10 g；MHB培養基（由北京索萊寶科技有限公司提供）；LB固體培養基：LB固體培養基需在LB液體培養基中加入7.5 g瓊脂后高溫高壓滅菌，在培養基溫熱時倒入無菌培養皿中，待凝固后備用。以上培養基均經過高溫高壓滅菌。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 大腸桿菌EutJ、EutG過表達菌株的構建? 將實驗室超低溫冰箱保藏的ASKA文庫中的帶有pCA24N（eutJ）、pCA24N（eutG）的菌株JM109選取出來，劃線至帶有氯霉素抗性的平板中，于恒溫培養箱培養16 h后，挑取帶有pCA24N（eutJ）、pCA24N（eutG）的菌株單克隆進行菌落PCR，將PCR產物用1%瓊脂凝膠電泳分離，并送樣測序。待測序正確后，用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit試劑盒提取質粒。在微融的野生型大腸桿菌BW25113感受態中加入2 μL提取的質粒，冰上靜止30 min后，在預熱充分的42℃金屬浴上熱激90 s，迅速放于冰上靜止2 min，在EP管中加入1 mL LB后，放置搖床復蘇1 h，將復蘇后的菌液濃縮涂布于含有氯霉素的抗性板中，與37℃恒溫培養基過夜培養后，挑取單菌落接種于LB，培養至平臺期后保菌備用。

1.2.2? 考馬斯亮藍染色法驗證蛋白表達情況? 將保藏的過表達菌株接種于新鮮LB，過夜培養至平臺期后，以1∶100轉接于含35 μg·mL-1 氯霉素的LB中，以220 r·min-1，37℃搖床培養至對數期OD600 0.45～0.55后，加入終濃度為1 mmol·mL-1的IPTG，搖床誘導30 min后，取500 μL菌液于1.5 mL EP管中，用12000 r·min-1離心2 min，徹底去除上清，加入25 μL 10% SDS溶液和25 μL Loading Buffer，震蕩混勻后，于99.9℃金屬浴煮樣15 min，待樣品澄清透明后，冷卻至室溫。將獲得的蛋白樣用15%的SDS-PAGE凝膠電泳進行分離。分離完成后用將膠切下考馬斯亮藍R250染色40 min，染色至蛋白分離膠呈深藍色后，用洗脫液洗脫至清晰的蛋白條帶出現。

1.2.3? EutJ、EutG過表達菌株對氨基糖苷類抗生素慶大霉素耐受性測驗? 將平臺期BW25113-pCA24N（empty）、BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）接種于新鮮LB，以1∶100轉接于含35 μg·mL-1 氯霉素的LB中，置于搖床培養至對數期OD600 0.45～0.55后，加入終濃度為1 mmol·mL-1的IPTG，搖床誘導30 min，取100 μL菌液于EP管中，12000 r·min-1離心去上清，加入同體積的0.01 mol·L-1 PBS緩沖液重懸作為對照樣品備用。取誘導至OD600≈0.8的菌液1 mL于滅菌后的玻璃搖菌管。分別加入終濃度5 μg·mL-1慶大霉素，在處理時間1、2、3 h分別取100 μL菌液，12000 r·min-1離心去上清，加入同體積的0.01 mol·L-1 PBS緩沖液，充分混勻作為處理樣品備用。將以上樣品用PBS緩沖液10倍稀釋后點板，吹干后放置37℃培養箱培養12 h后觀察菌的生長狀況。

1.2.4? EutJ、EutG過表達菌株對慶大霉素MIC測定? 將慶大霉素用2倍稀釋法在含氯霉素的MHB培養基中稀釋成相應濃度（0、0.5、1、2、4、8、16、32 μg·mL-1），再分別取200 μL含慶大霉素MHB培養基按照濃度從小到大排列加入96孔板中備用。將平臺期BW25113-pCA24N（empty）、BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）轉接于新鮮MHB培養基中，搖床培養至對數期OD600 0.45～0.55，用1 mmol·mL-1 IPTG誘導30 min后，將得到的OD600≈0.8的菌液1∶5稀釋，取2 μL稀釋后的菌液加入對應的板孔中。將加樣完畢的放置在37℃培養箱中，靜置培養24 h后，用移液槍輕輕吹打菌液混勻，觀察菌株在不同濃度抗生素條件下的生長情況。

1.2.5? EutJ、EutG過表達菌株胞內慶大霉素濃度測定? 為測試BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）對慶大霉素耐受性是否是由于對抗生素的攝取減少導致的。首先將野生型BW25113培養至OD600≈0.3，用PBS稀釋50后，取1 mL菌液均勻的涂布在含有固體LB培養基的10 cm×10 cm方型培養基上晾干備用。其次將BW25113-pCA24N（empty）、BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）培養至OD600≈0.5，加入終濃度為1 mmol·mL-1的IPTG誘導30 min后，取50 μL菌液離心去上清，再加入等體積的PBS緩沖液，震蕩后點板在瓊脂培養基上。另取2個1 mL誘導后的BW25113-pCA24N（empty）、BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）菌液于玻璃搖菌管中，在上述菌液中加入終濃度15、25 μg·mL-1 Genta置于37℃、220 r·min-1搖床處理1 h。同時取900 μL BW25113-pCA24N（empty）菌液于1.5 mL EP管中，12000 r·min-1、離心2 min，徹底去除上清，加入25 μL溶菌酶工作液，分別加入濃度梯度為20、30、40、50、60 μg·mL-1的慶大霉素，渦旋充分震蕩后，放入搖床孵育1.5 h以制備標準品。待樣品處理完畢，取50 μL菌液離心去上清，加入等體積PBS緩沖液，震蕩后點板在瓊脂培養基上。另取900 μL處理后菌液在EP管中，同上述方法離心徹底去除上清后，加入25 μL溶菌酶工作液，充分渦旋，放入搖床孵育1.5 h制成處理樣品。將孵育后的標準品和處理樣品，用液氮反復凍融3次，每次10 s，使細胞充分破碎。為使溶菌酶失活，需用90℃金屬浴煮樣10 min。最后，取5 μL孵育后的標準品和處理樣品點在涂布過BW25113的方型培養基上。將點好樣品的方型培養基置于37℃恒溫培養箱過夜培養后觀察出圈情況。

2? 結果與分析

2.1? EutJ、EutG過表達菌株的構建

由圖1可知，所構建的EutJ、EutG過表達菌株目的基因長度正確。由圖2可知，目的片段eutJ、eutG基因測序結果與NCBI上大腸桿菌K-12 MG1655菌株eutJ、eutG基因一致。由圖3可知，考馬斯亮藍染色結果顯示BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）能夠表達目的蛋白EutJ、EutG。綜上結果表明EutJ、EutG過表達菌株構建成功。

2.2? 過表達EutJ、EutG菌株對氨基糖苷類抗生素慶大霉素的耐受分析

由圖4可知，BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）在抗生素未處理時的菌量基本一致，用5 μg·mL-1 Genta處理1 h后菌量無顯著差異，但處理2 h和3 h，相比于BW25113-pCA24N（empty），BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）存活菌量對比空質粒菌株高了4個數量級，呈現明顯的耐受表型，差異極顯著。結果表明，過表達EutJ、EutG能增加野生型大腸桿菌BW25113對慶大霉素的抵抗力。

2.3? EutJ、EutG過表達菌株對慶大霉素MIC測定

由圖5可知，BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）對慶大霉素的MIC為0～0.5 μg·mL-1，并未高于對照組，由此說明BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）不屬于耐藥菌。

2.4? EutJ、EutG過表達菌株胞內慶大霉素濃度測定

由圖6可知，與BW25113-pCA24N（empty）相比，BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）在15、25 μg·mL-1 Genta處理1 h的殺菌條件下，細菌存活率高2～3個數量級。根據圖7標準樣品出圈直徑繪制標準曲線如圖8所示。將圖7處理樣品抑菌圈對應直徑標準曲線可得到處理樣品胞內抗生素濃度。由圖9可知，BW25113-pCA24N（eutJ）、BW25113-pCA24N（eutG）相較于BW25113-pCA24N（empty）胞內慶大霉素含量減少。

3? 結論與討論

抗生素的發現為醫療、養殖、農業等領域帶來了巨大的好處，但抗生素的濫用也導致耐藥細菌的產生。因此，迫切需要開發新的抗生素以跟上細菌耐藥的步伐。目前可以通過基于全細胞的表型篩選、基于靶標的篩選或基因篩選來識別新的可藥用靶標和新類別的抗菌化合物[12]。

本研究通過表型驗證得到對慶大霉素耐受的乙醇胺代謝相關基因eutJ、eutG，通過MIC測試過表達EutJ、EutG的MIC不改變，即未產生耐藥菌。而研究表明，當細菌間歇性暴露于抗生素時，耐受性也可能在耐藥性的演變中發揮關鍵作用[20]。因此篩選能夠抑制這些耐受相關基因的靶向化合物顯得格外重要。本研究結果發現，大腸桿菌過表達EutJ、EutG能通過降低胞內抗生素水平來抵抗殺傷，極端自然條件或人為造成的高濃度抗生素環境是否會造成EutJ、EutG表達量自主上調，而EutJ、EutG的上調是如何造成胞內抗生素水平含量降低，是否有其他導致慶大霉素耐受的機制，例如，抗生素外排增加、代謝途徑變緩慢、ATP水平降低、活性氧水平降低等，有待進一步深入的探究。

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（責任編輯：林玲娜）