產脂肪酶菌株的篩選及鑒定

陳美蓮 白睿璇 林琳

陳美蓮，白睿璇，林琳.產脂肪酶菌株的篩選及鑒定[J].福建農業科技，2023，54（9）：63-68.

收稿日期：2023-08-20

作者簡介：陳美蓮，女，1987年生，博士，助理研究員，主要從事微生物學分子生物方面研究。

基金項目：福建省教育廳中青年教師教育科研項目（JAT190627）；福建省自然科學基金項目（2020J05177）。

摘? 要：為了挖掘更多的產脂肪酶菌種資源，通過橄欖油平板檢測（透明圈觀察），采用高通量從海水、灘涂泥壤以及濱海植物分離篩選了324株真菌菌株，在pH 9.4的平板上篩選獲得了48個候選產脂肪酶菌株；經ITS序列分析，初步鑒定了其中的12個菌株，分別為鐮刀菌、青霉屬、枝孢菌、交鏈孢屬等，其中多數為枝孢屬和青霉屬；進一步利用氫氧化鈉滴定法檢測其中2個菌株（#89和#260）培養24 h的發酵液，#89菌株產生的脂肪酶酶活為（6.92±2.40）U·mL-1，#260菌株產生的脂肪酶酶活為（7.67±1.70）U·mL-1。

關鍵詞：脂肪酶；菌株資源；ITS序列；篩選

中圖分類號：Q 936??? 文獻標志碼：A??? 文章編號：0253-2301（2023）09-0063-06

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2023.09.010

Screening and Identification of Lipase-producing Strains

CHEN Mei-lian1，2， BAI Rui-xuan1， LIN Lin1，2

（1. College of Materials and Chemical Engineering， Minjiang University， Fuzhou， Fujian 350108，

China; 2. Institute of Oceanography， Minjiang University， Fuzhou， Fujian 350108， China）

Abstract： In order to explore more lipase-producing strain resources， 324 fungal strains were isolated and screened from the plants in seawater， coastal wetland & mud soil and coastal areas by high throughput through the olive oil plate detection （transparent circle observation）. Forty-eight candidate lipase-producing strains were screened on the plate with pH 9.4. Through the ITS sequence analysis， 12 strains were preliminarily identified as Fusarium， Penicillium， Cladosporium， Alternaria， etc.， most of which were Cladosporium and Penicillium. The fermentation broth of the two strains （#89 and #260） cultured for 24 h was further detected by using the titration method of sodium hydroxide. The lipase activity produced by #89 strain was （6.92±2.40） U·mL-1， and the lipase activity produced by #260 strain was （7.67±1.70） U·mL-1.

Key words： Lipase； Strain resources； ITS sequence； Screening

脂肪酶（Lipase，EC3.1.1.3），即三酰基甘油?；饷?，是一類特殊的酯鍵水解酶，可催化水解、酯化、酯交換、對映體拆分等多種化學反應[1]。與化學催化劑相比，脂肪酶催化的反應具有低能耗、選擇性好和轉化率高等優點，被廣泛應用于洗滌工業、食品加工、醫藥和化妝品生產、生物能源合成和皮革加工等多個工業領域[2-3]。

微生物脂肪酶種類多、作用溫度和pH值范圍廣泛、穩定性和活性均較高、且對底物純度要求不嚴、便于工業生產和獲取，是工業脂肪酶的主要來源。據統計，2018年微生物脂肪酶的市場消費約為4.25億美元，預計到2023年將達到5.902億美元[4]。隨著高效篩選技術和基因工程、蛋白質工程技術的應用，目前已有不少微生物脂肪酶實現了商業化生產[5]。我國雖也很早開始開展對脂肪酶的研究開發，但目前已實現工業化生產的菌種種類少、產量低，多數企業還是依賴昂貴的進口脂肪酶，因此，挖掘新的或質量更優的脂肪酶產生菌種具有重要研究意義。目前常用的產脂肪酶菌株的初篩方法主要有：以溴甲酚紫為指示劑的油脂平板篩選法、以羅丹明 B為指示劑的平板篩選法、三丁酸甘油酯平板透明圈法、以橄欖油乳化液為底物的平板透明圈法等，通過以上方法，越來越多的產脂肪酶菌株被篩選獲得[6-10]。而ITS序列，指真菌5.8S、18S和28S rDNA序列之間的轉錄間隔（Internal Transcribed Spacer），在自然中變異較快，在絕大多數真菌中表現出序列多態性，且其序列片段較小，易于分析，故被廣泛用于快速鑒定各種真菌[11]。

篩選不同來源的脂肪酶產生菌是脂肪酶研究的基礎，特別是一些極端環境或特殊生境中的產脂肪酶菌種具有重大開發潛力。生活在海水、灘涂泥壤以及濱海植物中的微生物，因其特殊的生境，具有更高的耐鹽性、耐堿性等抗逆性，同時也可能具有更好的酶學特性。因此，本研究以橄欖油為底物，通過橄欖油平板檢測（透明圈觀察），采用高通量從海水、灘涂泥壤以及濱海植物分離篩選324株真菌菌株，在pH 9.4的堿性平板上初步獲得候選脂肪酶產生菌，并通過ITS序列分析鑒定了其中的12個菌株，研究結果可為后期的脂肪酶酶學性能改造研究（如產酶最適條件優化、作用條件改進等）提供基礎數據，從而拓展微生物脂肪酶的應用價值。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料

1.1.1? 供試菌株? 海洋生物與藥物福建省高校工程研究中心從海水、灘涂泥壤以及濱海植物中分離得到的真菌（共324株），并以菌絲塊置于無菌水（含20%甘油）中，于-20℃凍存。

1.1.2? 主要藥品及試劑? PDA預制粉末（主要成分為馬鈴薯浸粉6 g·L-1、葡萄糖20 g·L-1、瓊脂 20 g·L-1，青島高科園海博生物技術有限公司），橄欖油、氫氧化鈉、氯化鉀、異丙醇（分析純，國藥集團化學試劑有限公司），聚乙烯醇124型、甘氨酸（上海麥克林生化科技股份有限公司），Taq PCR Mix、DNA Marker[天根生化科技（北京）有限公司]；引物由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

1.1.3 ??試驗儀器? 電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗室設備公司）、勻漿機（江蘇東鵬科技有限公司）、超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）、智能光照培養箱（寧波賽福實驗儀器有限公司）、多樣品組織研磨儀（上海凈信實業發展有限公司）、臺式離心機（艾本德中國有限公司）、微量紫外分光光度計（賽默飛世爾科技公司）、基因擴增儀（北京東勝創新生物科技有限公司）、凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）、pH計（德國賽多利斯公司）等。

1.2? 試驗方法

1.2.1? 菌株的活化與培養? 在無菌條件下，切取一小塊供試菌株的菌絲塊，轉接至新的PDA固體培養基平板上進行活化，于恒溫培養箱中，28℃、黑暗、倒置培養3～5 d，拍照記錄供試菌株的菌落形態。

1.2.2? 橄欖油固體平板制作? 量取適量橄欖油與2倍體積的4%聚乙烯醇混勻，勻漿器高速攪拌使之乳化；在緩沖液（不同pH值）中加入2%瓊脂，加熱融化后與適量的橄欖油乳化液（5%）混勻，制成厚度約為2 mm的橄欖油固體平板，用打孔器等距離打孔（孔徑為2 mm）。

1.2.3? 產脂肪酶菌株的平板篩選? 用無菌牙簽挑取一小團上述活化培養的供試菌株的氣生菌絲，轉接至橄欖油固體平板的孔中，于恒溫培養箱中，28℃、黑暗、正置培養1～5 d，在此期間，每天觀察并記錄透明圈的形成情況，并拍照；有透明圈形成的菌株即為候選脂肪酶產生菌。

1.2.4? 候選產脂肪酶菌株的基因組DNA的快速提取? 于1.5 mL無菌離心管中，加入少量石英砂，及420 μL提取緩沖液（1 mol·L-1 KCl），切取適量菌絲塊（約5 cm×7 cm）于上述離心管中，利用多樣品組織研磨儀進行組織破碎，65 Hz振蕩2 min，之后12000 r·min-1，離心10 min；吸取200 μL上清液至新的離心管中，加入0.6倍體積（即120 μL）的異丙醇，上下顛倒混勻，于-20℃冷凍1 h以上，使DNA沉淀；之后12000 r·min-1，離心10 min，棄上清液；用70%乙醇洗滌1次，12000 r·min-1，離心5 min后，棄乙醇，室溫下靜置5～10 min，待酒精揮發之后，加入60 μL無菌水，溶解DNA；樣品保存于4℃冰箱。

1.2.5? 候選產脂肪酶菌株的ITS序列擴增、測序分析? 按上述步驟提取候選菌株的基因組DNA，利用ITS序列通用引物（ITS1：5′CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA 3′，ITS4：5′TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′）進行PCR擴增，取少量產物進行凝膠電泳驗證，確認有條帶后，再將所得PCR產物送公司（生工生物）測序，最后通過NCBI的Blast功能（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi），將上述測序所得的樣品ITS序列與數據庫（如GenBank）中已知序列進行比對分析。

1.2.6? 產脂肪酶菌株發酵的粗酶液制備? 為進一步檢測候選菌株所產脂肪酶的活性，無菌條件下將上述獲得的候選產脂肪酶菌株接種于發酵培養基[橄欖油乳化液10

mL·L-1，（ NH4）2SO4 1 g·L-1，K2HPO4 1 g·L-1，MgSO4·7H2O 1 g·L-1，NaCl 0.5 g·L-1，蛋白胨20 g·L-1，蔗糖5

g·L-1，自然pH]中，28℃、180 r·min-1培養24～48 h，離心收集上清液，即為粗酶液。

1.2.7? 氫氧化鈉滴定法檢測粗酶液中脂肪酶活力? 將橄欖油乳化液與0.1 mol·L-1 Gly-NaOH（pH 9.4）緩沖液1∶3混合乳化后吸取8 mL于燒杯中37℃水浴5 min，加入50 μL 粗酶液后立即計時，反應10 min后將其放入95℃水浴中溫浴5 min終止反應，取出反應液后常溫放置2 min，再用pH計測量初始pH，用0.02 mol·L-1 NaOH滴定反應液至pH=10，記錄消耗NaOH體積，根據消耗的堿量計算其酶活力。

酶活（U·mL-1）=40×（V1-V2）×n÷t其中，V1為待測樣品消耗的NaOH體積（mL）；V2為空白對照消耗的NaOH體積（mL）；n為稀釋倍數；t為酶作用時間。

2? 結果與分析

2.1? 供試菌株的菌落形態觀察

由圖1可知，供試菌株的菌落形態各異，說明待測菌株比較多樣化。

2.2? 產脂肪酶菌株的篩選

采用橄欖油固體檢測平板篩選324株真菌菌株。由圖2可知，在堿性（pH 9.4）的檢測板中，有多個菌株（共48個）可形成透明圈，且透明圈大小不一（直徑為0.5～1.2 cm），以上結果說明這些候選菌株為堿性脂肪酶產生菌，且產生的脂肪酶活性強弱不一。

2.3? 候選產脂肪酶菌株的鑒定

2.3.1? ITS序列擴增與測序? ITS序列擴增的凝膠電泳結果（圖3）顯示，所檢測的樣品均是在750 bp左右有1條特異的條帶，符合ITS序列的特征，表明后續可直接將PCR產物送公司進行測序分析。

2.3.2? 測序結果比對分析? 由表1可知，ITS序列分析結果顯示，所檢測的12個候選產脂肪酶菌株分別有鐮刀菌、青霉、枝孢菌、交鏈孢屬等，主要鑒定到屬，其中多數為枝孢屬和青霉屬。

2.3.3? 脂肪酶活力測定? 由圖4可知，所檢測的2個產酶菌株（#89、#260）在培養過程中，發酵培養液逐漸變清澈，推測是培養液中酶的底物（橄欖油乳化物）被消耗減少造成的，進一步說明了這兩個菌株產生的脂肪酶具有一定的活性。

由表2可知，在培養24 h所得的粗酶液中，#89菌株產生的脂肪酶酶活為（6.92±2.40）U·mL-1，#260菌株產生的脂肪酶酶活為（7.67±1.70）U·mL-1。橄欖油平板檢測結果顯示，所得粗酶液在平板上均能誘導透明圈產生，且#89的透明圈更大一些，但滴定結果是#260的酶活更高，推測可能跟堿滴定法的不穩定性以及菌株本身的產酶條件、作用pH范圍、作用溫度等有關，后續將通過其他試驗進一步驗證。

3? 結論與討論

本研究利用橄欖油平板透明圈法篩選，初步獲得了多個堿性產脂肪酶菌株，這些菌株主要來自海水、灘涂泥壤以及濱海植物中分離的真菌；進一步通過ITS序列分析，初步鑒定了其中的12個產酶菌株，多數為枝孢屬和青霉屬。后續將通過以下試驗進一步鑒定菌種及其產生的脂肪酶的酶學性能：一是觀察形態學特征，根據《常見與常用真菌》鑒別[12]；二是根據ITS序列比對結果，進一步構建目標菌株的ITS rDNA系統發育樹[13-14]；三是通過單因素試驗和正交試驗確定產酶條件[15]；四是結合平板檢測和對硝基苯酚法分析目標脂肪酶的酶學性質，以及不同條件對其活力、穩定性的影響等[16-17]。

相較于傳統的化學催化劑，脂肪酶具有高度的催化特異性，其帶來的副反應較少，對提升產物的品質有很好的作用。工業用脂肪酶大多來源于微生物，但由于天然微生物來源的脂肪酶的作用條件、穩定性等無法滿足諸多生產的實際需求，因此，國際范圍內工業上應用的脂肪酶主要是通過分子改造而獲得的具有優良特性的工程菌生產的。目前，丹麥的諾和諾德公司、美國的杜邦公司、荷蘭皇家帝斯曼集團以及丹麥的漢森公司是全球脂肪酶的主要供應商（http：//www.marketsandmarkets.com， 2020）。近幾年，國內在微生物產脂肪酶菌種的篩選、發酵條件的優化、基因工程及蛋白質工程改造等方面，均有深入研究并取得了一定的成果，但尚未見其大量應用于生產的相關報道。因此，挖掘更多酶活力高、產量高和成本較低的脂肪酶產生菌，或是運用已有的和開發新的技術去改良已知脂肪酶的酶學特性，均有利于提高微生物脂肪酶的應用前景，幫助其實現商業價值。

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（責任編輯：林玲娜）