不同檢測方法對奶牛嗜血支原體病流行病學的調查

劉志彬

香河縣農業農村局，河北廊坊 065400

0 引言

嗜血支原體（Mycoplasma wenyonii）是一種無細胞核、細胞壁和細胞器的原核生物，活動能力較強，形態多樣，大多寄生于紅細胞表面、血漿和骨髓中。嗜血支原體自1928年首次在切除脾的鼠體中發現以來，已在牛、豬、犬、兔、羊、雞等多種動物和人體內發現[1]。該病原體早期稱附紅細胞體，歸為立克次氏體目，但根據電鏡觀察及16S rRNA基因序列分析結果，因與肺炎支原體密切相關，被劃為支原體屬[2，3]。奶牛嗜血支原體病是由牛嗜血支原體引起的以發熱、黃疸、貧血為主要癥狀的人獸共患病，可經血液、消化道、蟲媒介等多種途徑傳播，四季流行，夏季多發。各年齡階段奶牛均可感染發病，出現體重下降，生長阻滯，懷孕奶牛流產或胎衣不下，泌乳牛產奶量明顯減少的多樣化臨床癥狀。感染奶牛通常發病較慢，呈隱性感染，是潛在病原體的攜帶者和重要傳染源，往往被養殖者忽視。同時，由于長期攜帶病原體，導致感染奶牛機體免疫力降低，容易造成其他病原微生物侵入而繼發或混合感染疾病。該病在奶牛養殖場流行較廣，感染率可達86.2%[4]，嚴重影響奶牛養殖經濟效益和健康發展。

準確鑒定病原體對及時預防和治療該病具有重要作用。目前，實驗室診斷該病方法較多，如鏡檢方法（包括直接血液涂片法、懸滴壓片法、姬姆薩染色法、瑞氏染色法）、血清學檢測方法、聚合酶鏈反應（PCR）法等。基層獸醫臨床多采用鏡檢方法作為常規檢測手段，但容易出現誤診，準確度不如PCR等分子生物技術高，要準確檢測病原體需進一步借助分子生物技術。因此，需尋求更接近PCR技術的常規檢測方法應用于臨床診斷，必要時進一步采用PCR確診。河北省香河縣奶牛養殖有一定規模，但針對該病的流行情況缺乏系統、全面調查。為了解該病在本地區的感染態勢，本研究于2021年3月—2022年7月在香河縣采集9 家奶牛養殖場2 562頭奶牛血樣，采用鏡檢和PCR結合方法進行嗜血支原體病原學檢測，分析感染情況，為防治奶牛嗜血支原體病提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗設計

2021年3—4月在香河縣8 家奶牛養殖場選取泌乳牛781 頭，每頭牛頸靜脈部位采集全血10 mL，裝入含3.8%檸檬酸鈉的離心管，-20 ℃保存備用。采用直接涂片法、血液懸滴壓片法、姬姆薩染色法、瑞氏染色法和PCR方法分別對781 份血樣檢測嗜血支原體，通過比對陽性率，選擇與PCR方法陽性率接近的鏡檢方法，同時對奶牛不同年齡階段、不同季節和垂直傳播的感染情況進行調查。2021年5月，在6 家奶牛養殖場根據不同年齡階段（犢牛、青年牛、泌乳牛）選取810 頭奶牛檢測嗜血支原體。2021年6月—2022年7月，在9 家奶牛養殖場選取971 頭奶牛根據不同季節分類檢測嗜血支原體。同時，另選取30 頭病原體陽性的妊娠奶牛，分別于產前7 d尾靜脈采血、產后新生犢牛臍靜脈采血，檢測垂直傳播的感染情況。

1.2 主要試劑

全血基因組DNA提取試劑盒購自Promega公司；r Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker、d NTP等PCR相關試劑購自TaKaRa公司；瑞氏染色液、姬姆薩染色液等試劑購自南昌雨露實驗器材有限公司。

1.3 引物

根據GenBank數據庫收錄的嗜血支原體 16S rRNA基因序列（登錄號：AY946266），利用Primer5.0軟件設計一對種特異性引物。上游引物F：5'-CGAACGAGTGGAACTTGTTCTGC-3'，下游引物R：5'-TAGTACCATCAAGGCGTGCTC-3'，由上海英駿生物技術有限公司合成。預計擴增片段大小為415 bp。

1.4 鏡檢方法

參考楊紅英[4]等報道的方法對血液樣本分別采用血液懸滴壓片法、直接涂片法、姬姆薩染色法、瑞氏染色法進行嗜血支原體鏡檢，并觀察結果。陰陽性結果判斷標準：每份血液樣本在4×100 倍光鏡下觀察20 個視野，紅細胞中可見1 個嗜血支原體者，判為陽性，未觀察到嗜血支原體者，判為陰性。

感染強度判定標準：每份血樣記數100 個紅細胞，紅細胞感染率≤25%者為“＋”；25%＜紅細胞感染率≤50%者為“＋＋”；50%＜紅細胞感染率≤75%者為“＋＋＋”；75%＜紅細胞感染率≤100%者為“＋＋＋＋”[5]。

1.5 PCR 檢測

取血液樣本以3 500 r/min離心5 min，收集上清液，按照全血基因組DNA提取試劑盒說明書提取DNA，以DNA為模板，利用P1/P2引物進行PCR擴增檢測。50 μL擴增體系25 μL：d NTP 5 μL，MgCL2 3 μL，r Taq DNA聚合酶1.25 μL，模板DNA 2 μL，上、下游引物各1 μL，加無菌水至25 μL。反應條件：94 ℃預變性10 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，運行共32 個循環，最后，72 ℃終延伸10 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統上觀察目的片段。

1.6 統計分析

采用SPSS 20.0軟件對不同檢測方法結果進行方差檢驗，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果

2.1 不同方法檢測奶牛嗜血支原體陽性率的結果比較

采用4 種不同方法對7 8 1 頭奶牛血樣進行嗜血支原體檢測，結果發現（表1），懸滴壓片法、姬姆薩染色法、瑞氏染色法獲得血樣陽性率均高于PCR法，但各組之間差異不顯著（P＞0.05）。直接涂片法顯著高于其他檢測方法（P＜0.05）。

表1 不同方法檢測奶牛嗜血支原體陽性率的結果比較

2.2 不同年齡階段的奶牛嗜血支原體陽性率和發病率比較

懸滴壓片法和PCR法檢測泌乳牛感染的陽性率和發病率均顯著高于犢牛和青年牛（P＜0.05）。不同年齡階段的PCR感染陽性率和發病率依次為：泌乳牛＞犢牛＞青年牛（表2）。

表2 不同年齡階段的奶牛嗜血支原體陽性率和發病率比較

2.3 不同季節的奶牛嗜血支原體陽性率和發病率比較

夏季奶牛嗜血支原體陽性率最高（表3），P C R 檢測陽性率6 0.8 5%，與其他季節差異顯著（P＜0.05）；秋季顯著高于春季和冬季（P＜0.05）。

表3 不同季節的奶牛嗜血支原體陽性率和發病率比較

2.4 奶牛嗜血支原體的垂直傳播情況

選擇無任何臨床癥狀的陽性妊娠奶牛所產的30 頭新生犢牛，采用血液懸滴壓片法檢測嗜血支原體陽性率為83.33%，PCR法陽性率73.33%，妊娠奶牛、新生犢牛發病率分別13.33%、10.00%（表4），兩者無顯著性差異（P＞0.05），結果表明嗜血支原體可由妊娠奶牛垂直傳播給犢牛。

表4 奶牛嗜血支原體的垂直傳播情況

3 討論

近年來，我國奶牛養殖規模化程度逐步提高，飼養管理走向精細化，但一些奶牛養殖場的飼養管理技術和疫病防治手段還無法徹底遏制嗜血支原體病的傳染，尤其是大量散養模式生產進一步增加了防控難度。此外，從該病流行特點看，感染奶牛多無臨床表現，發病率不高，而嗜血支原體陽性率仍較高，流行廣泛，且病原體可經母體垂直傳播，這給該病凈化防控帶來很大困難。因此，在嗜血支原體感染奶牛早期，采取科學有效的診斷方法發現并及時確診，對了解奶牛感染水平和實施疫病凈化措施尤為重要。

目前，常規的奶牛嗜血支原體病原學診斷方法主要為血液鏡檢方法和PCR法[6]。血液鏡檢方法是診斷附紅細胞體病常用方法之一，但存在許多不足，容易造成誤診[7]。本研究采用4 種不同檢測方法對781 頭奶牛血樣進嗜血支原體檢測，發現直接涂片法、血液懸滴壓片法、姬姆薩染色法、瑞氏染色法獲得血樣陽性率均高于PCR法，這與周作勇等[8]報道一致。分析原因主要有：一是直接涂片法和血液懸滴壓片法都容易導致紅細胞變形而被誤判為陽性血樣，出現假陽性樣本，造成感染率高于實際數量。瑞氏染色法和姬姆薩染色法也都可能存在染色液顆粒沉著于紅細胞表面而被誤判為嗜血支原體。二是奶牛可能同時感染嗜血支原體和其他形態相似于嗜血支原體的血液寄生蟲（如無形體），鏡檢時很難區別[8]。作為現代分子生物技術的PCR法具有靈敏性高、特異性、準確性可靠的特點[9]，適合群體性檢測，可作為實驗室確診手段之一。本研究結果顯示，血液懸滴壓片法最接近PCR法的檢測結果，臨床上可采用該法作為早期診斷，必要時結合PCR法確診，有助于提高感染率準確性。

奶牛感染嗜血支原體不分年齡階段，但年齡差異影響陽性率高低。黃占欣等[5]報道，邯鄲地區奶牛附紅細胞體感染率和發病率中，犢牛感染率最高為62.3%、發病率為9.2%，其次是泌乳牛感染率為52.6%、發病率為1.9%，而青年牛感染率和發病率相對較低，分別為48.2%和0.0%。本研究結果顯示，不同年齡階段PCR感染陽性率和發病率依次為：泌乳牛＞犢牛＞青年牛，其中泌乳牛與犢牛、青年牛具有顯著差異。上述研究結果可能與自然飼養環境、奶牛感染強度、檢測方法等因素有關。

季節性也是影響奶牛感染嗜血支原體的重要因素，雖然該病發生無明顯季節性，但吸血節肢動物（螨、蜱、虱、蚊、蚤、螫蠅、蠓等）是動物嗜血支原體傳播擴散的主要媒介，若在夏秋季節，即吸血節肢動物的孳生時期，在應激因素影響下可能引起地方性流行[10]。本研究結果顯示，夏季是該病感染的高發期，顯著高于其他季節（P＜0.05），其次為秋季。雖然夏季發病率最高，但與其他季節無差異顯著性（P＞0.05）。夏季氣溫高，多雨潮濕，圈舍環境易滋生蜱、螨等吸血節肢動物，奶牛感染嗜血支原體與體外寄生蟲密切相關。因此，建議在每年夏季來臨前、夏季感染高峰期間和初秋3 個時間節點集中進行藥物防治和衛生消毒。本研究發現感染嗜血支原體的奶牛陽性率高，而發病率相對偏低，表明嗜血支原體致病力較弱，這與彭海生等[11]研究一致。

垂直傳播是奶牛嗜血支原體感染途徑之一。本研究中30 頭妊娠母牛均感染嗜血支原體，發病率13.33%，經過分娩，30 頭新生犢牛血液懸滴壓片法的檢測陽性率為83.33%、PCR法的陽性率為73.33%，表明無論發病或隱性感染，妊娠奶牛都可通過垂直傳播感染新生犢牛。這與李玉文等[12]、李子平等[13]和閆振貴等[14]報道一致。

4 小結

本研究發現，在常規的血液鏡檢方法中，血液懸滴壓片法準確度最接近PCR法，可用于奶牛嗜血支原體的臨床確診。采用這兩種方法檢測香河縣奶牛感染嗜血支原體情況，結果顯示奶牛感染率偏高而發病率低，夏季多發，泌乳牛感染率和發病率顯著高于犢牛和青年牛。建議根據該病流行特點，加強疫病凈化，減少傳播風險。