紅花黃色素與牛血清蛋白的相互作用研究

劉萍，郭嘉鑫，劉中天

（商洛學院化學工程與現代材料學院/陜西省尾礦資源綜合利用重點實驗室/陜西省礦產資源清潔高效轉化與新材料工程研究中心，陜西商洛 726000）

牛血清蛋白（Bovine serum albumin，簡稱BSA）為淡黃色晶體顆粒，易溶于水。在蛋白質與藥物的相互作用研究中，牛血清蛋白是常用的蛋白質選取對象。BSA是牛血清中的一種球蛋白，與人血清蛋白（HSA）具有相類似的氨基酸組成和排列順序。由于牛血清蛋白在結構上與人血清蛋白高度近似，本身又結構穩定、容易獲取且價格低廉，因此常被用作HSA的替代品。藥物一直與人類生活密切相關，從藥物進入人體到起效，要經歷釋放、與靶點相互作用和代謝三個過程。藥物在體內的吸收和代謝情況，會直接影響藥物在目標部位的濃度及持續生效的時間，也決定著藥物的功效和穩定性[1]。紅花，屬于菊科植物的干燥管狀花，是一種傳統的草藥，可以通過消除血瘀來激活血液循環和緩解疼痛。紅花及其主要活性成分紅花黃色素和羥基紅花黃色素A（HYSA）已被開發成多種藥用產品，如紅花和HYSA注射液，主要用于治療心血管疾病，臨床療效明顯[2-5]。紅花黃色素易溶于水，是臨床上廣泛使用的查爾酮類化合物[6-7]，具有減輕疼痛、降低膽固醇和血壓的作用。因此，了解紅花黃色素和BSA作用的機制，并結合理論分析其結合的參數，對醫生可以幫助指導臨床的醫學實踐，對藥理工作者有助于完成新藥的設計與篩選，減輕藥物的副作用，為尋找新藥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UV-1200紫外可見光譜儀（上海光譜儀器有限公司）、F-4600熒光光譜儀（日本日立高新技術公司）、JV-2004N電子天平（南京精密科學儀器有限公司）、DG-214恒溫水浴鍋（石家莊天宇實驗儀器公司）、pHs-3c pH計（上海分析儀器廠）。

試驗所用的紅花黃色素（麥克林試劑有限公司）、BSA（美國Sigma公司），三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、硫酸銅、氯化鎳、氯化鋅、氫氧化鈉均為上海國藥化學試劑有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 Tris-HCl緩沖液儲備液

稱取12.114 g三羥甲基氨基甲烷，加入5.844 g NaCl，溶于蒸餾水中，用HCl或NaOH，調節溶液pH值為7.4，然后再加蒸餾水定容至1 000 mL，制備濃度為0.1 mol/L Tris-HCl緩沖常溶液。

1.2.2 BSA儲備液

稱取0.133 6 g BSA，將其放入100 mL容量瓶中，用Tris-HCl緩沖溶液溶解，然后用Tris-HCl緩沖溶液補足體積，制備濃度為2×10－5mol/L BSA溶液，并在4℃的冰箱中保存。

1.2.3 紅花黃色素儲備液

稱取0.019 4 g紅花黃色素，放入100 mL容量瓶中，用Tris-HCl緩沖溶液溶解，然后用緩沖溶液補足體積至刻度，制備濃度為1×10－4mol/L紅花黃色素。

1.2.4 紫外吸收光譜法測定

分別準確移取 3.0 mL 2×10－5mol/L BSA 溶液和3.0 mL 0.1 mol/L Tris-HCl緩沖溶液于兩個1 cm石英比色皿中，以Tris-HCl緩沖液為參比溶液，先測試BSA溶液的紫外吸收光譜，然后用微量進樣器分別向BSA溶液比色皿和參比溶液比色皿中加入一定體積的紅花黃色素溶液（紅花黃色素的累加體積為100 μL），混合均勻，保持10 min后，以相應濃度的紅花黃色素溶液為參比測試BSA與紅花黃色素混合溶液的紫外吸收光譜。

1.2.5 熒光光譜法測定

分別在283 K和310 K溫度下，準確移取3.0 mL 2×10-5mol/L BSA溶液，置于石英比色皿中，分別加入相同濃度的紅花黃色素溶液，混合均勻，保持10 min后，以365 nm為激發波長，測試BSA和混合樣品的熒光光譜。

2 結果與討論

2.1 紫外光譜法

2.1.1 紅花黃色素與牛血清蛋白的結合常數

用紫外光譜法測定紅花黃色素與BSA的結合常數，紅花黃色素與BSA的結合可以表示為：

其中，[P]為游離受體BSA的濃度，KA為結合常數，K0為解離常數，[Q]為紅花黃色素的濃度，[QP]為結合物濃度，[P0]為受體BSA總濃度。

當生成物QP不存在紫外吸收時，游離的受體蛋白的摩爾濃度可用相應的紫外吸收強度表示為：

經整理式(1)～式(5)得：

其中，以(A0-A)-1對[Q]-1作Lineweaver-Burk雙倒數曲線圖，藥物與蛋白質結合常數KA可以從該圖的斜率和A0求得。

BSA在280 nm附近的吸收峰是蛋白質的吸收峰，它能夠反映蛋白的骨架狀態。由此，可以從蛋白質的吸收峰強度和最大吸收峰位移的角度來分析和判定它們之間的結合。在283 K和310 K條件下，研究了不同濃度的紅花黃色素對BSA的紫外吸收光譜的影響，結果如圖1所示。由圖1顯示紅花黃素與BSA之間發生了一定的相互作用。圖2是將（A0－A)-1對[Q]-1在 283 K 和 310 K條件下，紅花黃色素與BSA相互作用的Lineweaver-Burk雙倒數曲線圖。通過擬合得到紅花黃色素與BSA在283 K和310 K下的相互作用的線性回歸方程，分別為y=1.044 38+1.802 72×10-5x，R=0.995 24 和 y=1.044 38+1.675 71×10-5x，R=0.993 11，結合常數KA分別為5.70×104L/mol和 6.34×104L/mol。

圖2 283 K和310 K時紅花黃色素與BSA相互作用的Lineweaver-Burk曲線

2.1.2 紅花黃色素與牛血清蛋白的結合作用力

考慮到血清蛋白的結構復雜，它和藥物小分子之間通常有多種作用力。蛋白大分子與藥物小分子之間的作用力包括范德瓦爾斯力、氫鍵、疏水力和靜電引力。當反應的焓變大于零，熵變不低于零時，分子間相互作用力為疏水力。當反應的焓變不大于零，熵變不低于零時，分子間相互作用力為靜電引力。當焓變小于零和熵變小于零時，分子間相互作用力為范德瓦爾斯力和氫鍵。當自由能變化（ΔG）＜0時，小分子之間的相互作用可以自發發生。如果溫度變化不大，可以認為ΔH是常數，計算公式為：

式(7)中，K1、K2是在溫度 T1和 T2下牛血清蛋白與藥物小分子的結合常數，即為Lineweaver-Burk靜態猝滅常數。

通過計算作用前后的熱力學數據，如ΔH和ΔS的大小，能夠判斷藥物小分子與蛋白質之間的作用力類別，結果如表1。由表1可見，BSA與紅花黃色素的結合過程的 ΔH＜0，ΔS＞0，同時ΔG＜0，因此該過程是一個同時受到焓和熵二者共同驅動完成的自發過程，二者之間的作用力類型主要是靜電引力。

表1 紅花黃色素與BSA相互作用的熱力學參數

2.1.3 共存金屬離子對紅花黃色素與BSA結合常數的影響

各種微量元素是生物體維持正常生命活動必不可少的物質。因此，研究微量元素離子對小分子藥物與BSA結合常數的影響情況，是獲得藥物小分子與生物體內的藥理活性信息的重要手段。本研究選擇三種常見的Cu2+、Ni2+和Zn2+作為共同存在的金屬離子，在pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液中，測定了它們在310 K時對紅花黃色素與BSA結合常數的影響情況。圖3為Cu2+、Ni2+和Zn2+存在時的Lineweaver-Burk曲線，其線性回歸方程、線性相關系數和結合常數的結果見表2。由表2可以看出，所選的三種金屬離子和BSA之間均有一定程度的結合，形成的鍵會影響到蛋白質結構的變化[8]。在金屬離子存在時，紅花黃色素與BSA的結合常數有微弱的減小，說明金屬離子的加入使得二者的結合能力略有降低，從而證明Cu2+、Ni2+和Zn2+與紅花黃色素之間存在著競爭效應，紅花黃色素在血漿中的儲存時間有所縮短，藥物作用的效率有所提高[9-10]。

圖3 共存金屬離子存在時紅花黃色素與BSA相互作用的Lineweaver-Burk曲線

表2 金屬離子對紅花黃色素-BSA體系結合常數的影響

2.2 熒光光譜法

2.2.1 紅花黃色素對牛血清蛋白的熒光猝滅

熒光光譜可以幫助了解藥物與蛋白的結合信息，結合位點數等結合特征的參數。為了考察紅花黃色素對BSA熒光光譜的影響，保持BSA的濃度固定不變，改變紅花黃色素的濃度，測試了二者在283 K和310 K時相互作用的熒光光譜，見圖4。由圖4顯示，牛血清蛋白的內源性熒光強度，會伴隨著紅花黃色素濃度的增加而逐漸降低，但其峰位和峰形大體保持不變，證明紅花黃色素對牛血清蛋白的熒光有猝滅效用。

圖4 不同溫度紅花黃色素對牛血清蛋白的熒光猝滅光譜

2.2.2 熒光猝滅的類型

其它分子與熒光分子發生相互作用導致熒光分子熒光強度和壽命減少的所有現象，被稱作熒光猝滅。熒光猝滅包括動態猝滅和靜態猝滅兩種類型。如果溫度升高，Stern-Volmer猝滅常數KSV增大，此時熒光體與熒光猝滅分子之間屬于動態猝滅類型。其原因是有效碰撞的幾率隨著溫度的升高而增大，電子轉移的過程得到了促進。相反如果升高溫度，猝滅結合常數減小，則說明屬于靜態猝滅類型[1]。

動態猝滅過程遵循Stern-Volmer方程：

式(10)中，F為加入藥物濃度為[Q]時熒光物質的熒光強度，KSV為Stern-Volmer猝滅常數，Kq是猝滅速率常數，F0為不加猝滅劑時熒光物質的熒光強度，τ0為不加猝滅劑時熒光分子的平均壽命。

將生物分子的熒光壽命τ0=10-8s帶入式(10)中，可以求出猝滅常數KSV和猝滅速率常數Kq[11-12]。運用動態猝滅的Stern-Volmer方程，在溫度283 K和310 K時，以F0/F對[Q]作圖，見圖5?？筛鶕M合曲線 y283K=7.247×104x+0.952 4，y310K=3.323 3×104x+1.015 3，所得結果見表3。由圖5可見，310 K時的曲線斜率明顯小于283 K時的曲線斜率，且Kq大于最大擴散碰撞猝滅速率常數，這是靜態猝滅類型的表現，因此紅花黃色素與BSA之間的熒光猝滅屬于靜態猝滅。

圖5 紅花黃色素對BSA熒光猝滅的Stern-Volmer曲線

表3 紅花黃色素與BSA間的熒光猝滅常數

靜態猝滅遵循Lineweaver-Burk雙倒數方程：

式 (11)中，KLB為猝滅劑與熒光物質的結合常數，F為猝滅劑濃度為[Q]時熒光物質的熒光強度，F0為猝滅劑濃度為零時熒光物質的熒光強度。KLB為猝滅劑與熒光物質的結合常數，又稱為Lineweaver-Burk猝滅常數。紅花黃色素猝滅牛血清蛋白的Lineweaver-Burk雙倒數曲線與(F0－F)-1和[Q]-1的關系，見圖6?？筛鶕M合曲線求得283 K和310 K時的靜態猝滅結合常數KLB值，見表3。由表3可見，隨著溫度升高KLB而減小，說明紅花黃色素對牛血清蛋白的熒光猝滅屬于靜態猝滅。

圖6 紅花黃色素對BSA熒光猝滅的Lineweaver-Burk曲線

2.2.3 結合位點數及結合常數

根據式(12)可以計算小分子藥物與大分子蛋白的結合位點數和結合常數。

式(12)中，F0為未加猝滅劑的熒光強度，F為加入濃度為[Q]的猝滅劑時的熒光強度。以lg[(F0－F)/F]對lg[Q]作圖，見圖7，通過線性擬合可以求得紅花黃色素與BSA的結合位點數(n)和結合常數(K)，結果見表4。由表4可見，紅花黃色素與BSA的結合位點數n約等于0.5，二者的結合常數隨著溫度的升高而減小。

圖7 紅花黃色素與牛血清蛋白的結合常數曲線

表4 結合位點數及結合常數

3 結論

通過紫外可見吸收光譜研究了中藥小分子紅花黃色素與牛血清蛋白（BSA）的相互作用情況，考查了溫度和共存金屬離子 Cu2+、Ni2+、Zn2+對二者結合常數的影響。采用熒光光譜研究了紅花黃色素對生物大分子BSA的熒光猝滅的類型及結合常數和結合位點數。紅花黃色素與BSA的結合作用力主要表現為靜電引力。結合常數隨溫度的升高而降低，結合常數的數量級約為104，并且二者的結合過程的 ΔH＜0，ΔS＞0，ΔG＜0，驅動力為 ΔH 和 ΔS，結合位點數為 0.5。在 Cu2+、Ni2+和Zn2+存在情況下，紅花黃色素與BSA的結合常數略小于無金屬離子存在，說明競爭效應存在于金屬離子和紅花黃色素之間，使得小分子藥物紅花黃色素在血漿中的存儲時間得到有效地縮短，進而提高了紅花黃色素的藥效。