一例山羊產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的診治報告

李 顯，石 艷，李 軍，李常挺，譚奕舟，譚文寶，彭 昊*

（1.廣西壯族自治區(qū)百朋種畜場545102；2.廣西大學動物科學技術(shù)學院530004；3.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所 廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室 530001；4.大化瑤族自治縣七百弄雞產(chǎn)業(yè)發(fā)展中心530800）

產(chǎn)氣莢膜梭菌又稱魏氏梭菌，是一種重要的人畜共患致病菌，是中國疾病預防控制中心列出的五種常見食源性感染或中毒的病原體之一[1]，其具有芽孢，屬于革蘭氏陽性桿菌。由于產(chǎn)氣莢膜梭菌能產(chǎn)生許多細胞外的強效蛋白質(zhì)毒素，引起許多不同的組織毒性和人類及動物的腸道毒性疾病。基于它們可產(chǎn)生四種類型毒素組合的能力-α 毒素、β 毒素、ε 毒素及ι 毒素，將產(chǎn)氣莢膜梭菌菌株分為A、B、C、D、E 五個血清型。最近根據(jù)新型毒素分型系統(tǒng)又分為F(cpe）型和G(net B）型。產(chǎn)氣莢膜梭菌F 型的菌株作為攜帶α 毒素基因和cpe基因并在孢子形成時產(chǎn)生cpe 的分離株，不攜帶β 毒素、ε 毒素或ι-毒素。而產(chǎn)氣莢膜梭菌G 型的菌株則被定義作為產(chǎn)生α 毒素和net B 毒素但不產(chǎn)生β 毒素、ε毒素或ι-毒素[2]。這些菌株已被證明是人類食物中毒和非食源性產(chǎn)氣莢膜梭菌介導的腹瀉的罪魁禍首，包括一些抗生素相關(guān)性腹瀉[2]。值得關(guān)注的是產(chǎn)氣莢膜A 型菌株的定義已發(fā)生變化，現(xiàn)在被定義為產(chǎn)生α 毒素，但不產(chǎn)生β 毒素，ε 毒素，ι-毒素，cpe 或netB[3]。

產(chǎn)氣莢膜梭菌介導的腹瀉，包括一些抗生素相關(guān)性腹瀉可廣泛存在于人類和動物腸道以及食物、河流和土壤等多種自然環(huán)境中[4]。作為一種常見的條件性致病菌，產(chǎn)氣莢膜梭菌能引起大多數(shù)哺乳動物胃腸道感染，產(chǎn)生腸毒血癥，還可以引起皮膚和軟組織氣性壞疽或惡性水腫。產(chǎn)氣莢膜梭菌的血清型不同，其感染引發(fā)的傳染性疾病也不同，如羊腸毒血癥、羊快役及羔羊痢疾，無論哪一種疾病都具有極高的致死率。不僅如此，還會導致屠宰加工環(huán)節(jié)的污染，增加人類食物中毒和消化道疾病的風險[5]。腸毒血癥是由產(chǎn)氣莢膜梭菌當中的某些特定血清型的細菌感染引發(fā)的一種急性腸道疾病，傳播速度較快，大多以暴發(fā)病為主。從易感群體來講，任何年齡品種的羊群都可能受到病原的入侵，尤其是采食欲望較為旺盛、膘情較好的青壯年羊群更容易感染，6 月齡至2 歲的羊是腸毒血癥暴發(fā)流行的高峰期。該疾病的發(fā)生具有一定的條件性和季節(jié)性。羊腸毒血癥是一種急性致死性的細菌傳染性疾病，其潛伏周期相對較短。大多數(shù)羊群在受到病原入侵之后，短時間內(nèi)會出現(xiàn)典型的臨床癥狀，倒地不起，全身痙攣，持續(xù)數(shù)分鐘之后就會死亡。某些抵抗能力較強的羊群受到病原入侵之后，發(fā)病相對較為緩慢，主要表現(xiàn)為行動遲緩，離群獨居，單獨站立或者臥地不起，結(jié)膜蒼白，失去光澤，精神狀態(tài)差。患病羊不斷磨牙、空嚼、角弓反張，同時伴隨嚴重的腹痛腫脹癥狀，排出的糞便呈現(xiàn)黑褐色或者黃褐色，部分患病羊排出的糞便當中會夾雜有大量的新鮮血液，但患病羊的體溫不會出現(xiàn)升高的現(xiàn)象。急性發(fā)病的患病羊從出現(xiàn)癥狀到死亡一般小于3 h，病情緩慢的羊群從發(fā)病到死亡能夠持續(xù)3 d 左右[6]。羊腸毒血癥是由D 型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染引起的病羊腹瀉，胃腸功能紊亂，甚至死亡的一種急性致死性傳染病，患病羊死亡后剖解可見其腎組織軟化，故又稱軟腎病[7]。該病多在春、夏兩季發(fā)生，呈現(xiàn)明顯的季節(jié)性，可能與春夏兩季氣溫多變，雨水較多，有利于該菌的繁殖，更多的飲水和多汁綠葉受到污染有關(guān)。此外，該病在英國、印度等國家均有發(fā)生，在我國東北和內(nèi)蒙古地區(qū)常有該病的流行。給養(yǎng)羊業(yè)帶來較大的經(jīng)濟損失。通過對南寧市隆安縣某黑山羊養(yǎng)殖場病羊的發(fā)病情況以及從該病病原、臨床癥狀、實驗室檢驗等方面進行分析，確診后提出了合理的疫病防控措施。現(xiàn)報告如下，供同行們參考。

1 發(fā)病情況

2022 年8 月份，南寧市隆安縣某黑山羊養(yǎng)殖場有羊只發(fā)病，該場存欄200 多只。據(jù)畜主反映，該場近期才開始由圈養(yǎng)改為放牧模式，夏季雨水較多，羊群到附近山上放牧采食，牧草水分含量較大，回來后晚上只補充精料而沒有飼喂干草等粗飼料。病羊主要是5～6 月齡羊只，累計發(fā)病10 余只，死亡2 只。剖解病羊并采集其病變組織做實驗室檢查。

2 臨床癥狀及病理變化

突然發(fā)病，健壯或者膘情好的羊只先發(fā)病，病羊步態(tài)不穩(wěn)，流涎，腹瀉并有黑色稀糞，體溫不高，病程短促、有的病羊數(shù)小時后死亡。解剖病羊發(fā)現(xiàn)，心包液體增多，心肌出血，肺臟充血，小腸黏膜充血、出血，腸壁呈血紅色，腎臟腫大，腎實質(zhì)松軟，泥狀，擠壓碎爛，肝臟、膽囊腫大，淋巴結(jié)腫大出血。

3 實驗室診斷

3.1 分離培養(yǎng)

無菌操作下，用接種環(huán)在肝、腸道等病變組織接種于血瓊脂平板上進行“Z”字形劃線，采用焦性沒食子酸厭氧方法培養(yǎng)18 h[8]。取干凈的載玻片，表面用點燃的酒精棉進行擦拭消毒，再用血平板上的菌落進行革蘭氏染色鏡檢。革蘭氏染色結(jié)果為：革蘭氏陽性，兩端鈍圓，粗大桿菌，無鞭毛。挑取單個菌落接種厭氣肉肝湯進行液體擴大培養(yǎng)。

3.2 生化鑒定

用無菌移液器吸取培養(yǎng)的分離菌液接種于石蕊牛奶試劑溶液，置于37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在石蕊牛奶培養(yǎng)基中呈現(xiàn)“爆乳發(fā)酵”現(xiàn)象。生化試驗結(jié)果表明，分離菌與產(chǎn)氣莢膜梭菌的生化特性一致。通過分離株的鏡檢結(jié)果結(jié)合生化鑒定的“爆乳發(fā)酵”現(xiàn)象，初步診斷該病是由產(chǎn)氣莢膜梭菌侵入羊只體內(nèi)所致。

3.3 16S rDNA 測序及序列分析

取分離菌液，利用16S rDNA 通用引物進行分離菌的PCR 擴增。PCR 擴增體系(總體積為50 μL)：2× ES Tap Master Mix 25 μL，模板DNA4 μL，上下游引物各2μL，ddH2O 17 μL。PCR 擴增程序：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。PCR 擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并對有條帶的PCR 產(chǎn)物進行測序。結(jié)果顯示擴增出約1428 bp 的片段，與目的條帶大小一致。將所得序列與BLAST 上比對，發(fā)現(xiàn)與NCBI 上參考菌株的產(chǎn)氣莢膜梭菌相似度在97%以上。

綜上，根據(jù)羊只的發(fā)病情況、臨床癥狀、病理變化、分離株的分離培養(yǎng)、鏡檢、生化試驗及16S rDNA 測序方法，最終診斷該病是由產(chǎn)氣莢膜梭菌D 型感染所致的羊腸毒血癥。

4 治療和預防措施

4.1 治療措施

羊腸毒血癥發(fā)病速度快，發(fā)病周期短，為了提高治愈成功率，應該大劑量地使用磺胺類藥物進行針對性的治療。首先給患病羊灌服10%生石灰水以加速毒素的中和及盲腸糞便轉(zhuǎn)化從而最大化的減少毒素在機體內(nèi)的擴散。成年羊200 mL/次，幼齡羊80 mL/次，均連續(xù)使用2～3 次。此外，急性病例羊群已無治療意義，但其他患病羊可以灌服大劑量的磺胺脒。患病羊每只灌服磺胺脒8～12 g，第一天1 次灌服，第二天分2 次灌服；內(nèi)服硫酸鎂從而排除病羊胃腸道內(nèi)的有毒物質(zhì)；肌肉注射青霉素，每只羊3 支160 萬IU 青霉素，2 次/d，連用3 d。對于病程較長的患病羊注射產(chǎn)氣莢膜梭菌的血清，進行毒素中和，并選擇使用20%安鈉咖注射液10 mL，5%葡萄糖生理鹽水注射液500 mL 靜脈注射，強化補液。此外，為了防止病情進一步擴散，采取隔離病羊，單獨飼養(yǎng)措施。增加羊群的運動量。通知該場使羊群盡量避免群體接觸，并用消毒威等消毒藥（成分為二氯異氰脲酸鈉1∶300 倍稀釋）對所有羊舍、場地進行全面消毒，每天2 次，連續(xù)7 d。此外，對該場所有健康羊群使用羊快疫、猝狙、腸毒血癥三聯(lián)滅活疫苗或羊快疫、猝疽、羔羊痢疾、腸毒血癥四聯(lián)干粉滅活疫苗（吉林正業(yè)生物制品股份公司）進行預防接種，肌肉或皮下注射，用20%氫氧化鋁膠生理鹽水溶液溶解，每只羊注射1 mL。

4.2 預防措施

4.2.1 加強飼養(yǎng)管理

飼養(yǎng)環(huán)境的好壞與羊腸毒血癥的發(fā)病率有直接聯(lián)系，潮濕污濁的環(huán)境也會引發(fā)該病。加之，該病發(fā)病急，無足夠的時間救治。因此，注重日常預防措施、加強飼養(yǎng)管理是防控該病的重要措施。對于圈養(yǎng)養(yǎng)殖模式，必須加強羊場的環(huán)境衛(wèi)生管理，改善飼養(yǎng)環(huán)境，杜絕環(huán)境受到該菌的污染，防止飼料和飲水受到污染，保證舍內(nèi)環(huán)境溫濕度適宜，羊舍夏天要注意降溫，及時消滅蚊蠅，保證圈舍的清潔衛(wèi)生，注意飼養(yǎng)密度，防止病原微生物的滋生。其次，定期做好日常消毒工作，尤其是受到污染的羊舍要徹底清洗消毒。一周消毒2 次，場內(nèi)一月消毒1 次，消毒過程中切記交替使用消毒液；針對水源及飲水槽等進行消毒，避免水源污染，同時，定期對羊只的飲用水進行細菌學檢測，觀察是否存在水質(zhì)超標。再次，注意飼料營養(yǎng)均衡，杜絕突然更換飼料造成應激，根據(jù)天氣情況，提前做好通風和保溫工作，避免溫差過大。對于放牧飼養(yǎng)模式，應注意要選擇地勢高的草地，防止羊群接觸可能含產(chǎn)氣莢膜梭菌的飼草、飲水和土壤，從而切斷羊群與傳染源的接觸機會，降低疾病發(fā)生概率。

4.2.2 免疫接種

鑒于產(chǎn)氣莢膜梭菌廣泛存在于自然界，其具有極強的傳染力，感染此病有發(fā)病急、病程短、高死亡率等特點，發(fā)病之后會在很大程度上影響到羊群的正常生長和生存。因此控制和預防羊腸毒血癥的最佳措施是給羊群接種含有D 型產(chǎn)氣莢膜梭菌類毒素的疫苗。每年各給羊群預防接種2 次，于春秋兩季進行，可以有效預防該病的發(fā)生。我國目前預防該病的常用疫苗主要為羊快疫、猝狙、羔羊痢疾、腸毒血癥四聯(lián)干粉滅活疫苗及羊快疫、猝狙、腸毒血癥三聯(lián)滅活疫苗。此外，規(guī)模化養(yǎng)羊場的疫病監(jiān)控工作是預防該病的重要措施，需要加強其監(jiān)控工作，根據(jù)本地區(qū)和周邊地區(qū)的疫情，結(jié)合羊群抗體水平及抗體消長規(guī)律，建立適合的科學免疫制度，是預防該病的重要措施之一。

5 結(jié)語

產(chǎn)氣莢膜梭菌的發(fā)病一般呈急性經(jīng)過，而且傳染性較強，留給治療的時間比較短，給養(yǎng)殖戶帶來了嚴重的經(jīng)濟損失。羊腸毒血癥是一類腸道消化道疾病，是羊群的常見疫病之一，其病原菌為D 型產(chǎn)氣莢膜梭菌，該菌在羊腸道內(nèi)大量繁殖，并產(chǎn)生毒素引起病羊腹瀉，胃腸功能紊亂，毒素中毒，甚至死亡。該病在養(yǎng)殖場發(fā)生流行率較高，具有發(fā)病急、病程短、死亡率高、傳染性強等特點，若防治措施不當，一旦出現(xiàn)羊只發(fā)病就會造成疾病的迅速蔓延，導致羊群大批死亡，給養(yǎng)羊戶造成嚴重的經(jīng)濟損失。此病主要以預防為主，治療為輔。因此，要制定科學的飼養(yǎng)管理制度，日常管理期間做好預防，加強羊只免疫接種，使羊群的抗體水平達標，有效防御產(chǎn)氣莢膜梭菌的入侵。本次診斷提出了相應的治療及預防措施，希望對降低該種疾病的發(fā)生流行概率，保證養(yǎng)殖戶羊群的安全有一定作用。此外，羊群的飼養(yǎng)管理尤為重要，應飼喂配比合理的飼料，避免突然換料或者改變飼養(yǎng)條件，飼料改變要逐步過渡，定期進行消毒，做好免疫接種工作，降低此病的發(fā)病率，促進養(yǎng)羊業(yè)的發(fā)展。