地塞米松對異氟醚麻醉手術大鼠SIRT1/NF-κB信號通路的影響

高勤 左友波 劉琪琳

(川北醫學院附屬醫院麻醉科,四川 南充 637000 )

異氟醚是臨床常用的吸入性全身麻醉藥物,麻醉誘導平穩、迅速、舒適,蘇醒快,肌肉松弛良好,且無交感神經系統興奮作用[1]。有研究報道,異氟醚可能誘導大鼠腦神經細胞凋亡,從而嚴重影響其腦功能,而且這種影響可長期存在,甚至出現行為功能障礙[2]。故對異氟醚麻醉導致術后認知功能障礙誘因、預防、診斷及治療的分析成為研究熱點。地塞米松可用于風濕性疾病、嚴重過敏、哮喘、腦水腫等多種疾病[3]。近年來,研究報道地塞米松在修復血腦屏障[4]、減輕神經損傷[5]方面發揮重要作用。韓佳[6]研究顯示,地塞米松可降低七氟烷所致新生大鼠記憶障礙和神經元損傷,可能與上調沉默信息調節因子1(silent information regulator 1,SIRT1)表達有關。由此推理,地塞米松在異氟醚麻醉引起的認知功能損傷中可能也存在保護作用。核因子(nuclear factor,NF)-κB通路是經典的炎癥信號通路,SIRT1可負向調控NF-κB表達,抑制炎癥反應水平,在腦組織炎性損傷中有重要作用。為了評價地塞米松對異氟醚麻醉手術大鼠認知功能及SIRT1/NF-κB信號通路的作用,本研究將通過吸入異氟醚模擬異氟醚麻醉狀態,觀察地塞米松處理后大鼠認知功能、海馬區形態學改變、炎癥細胞因子水平及SIRT1/NF-κB信號通路蛋白的影響,為臨床麻醉藥物的合理使用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要儀器 R419型動物麻醉呼吸機(深圳瑞沃德生命科技有限公司),XR-XM101型Morris水迷宮實驗系統、XR-XX117型物體位置識別系統(上海欣軟信息科技有限公司)。

1.2 主要藥品與試劑 地塞米松片(國藥準字H44024618,批號190520)購自廣東南國藥業有限公司,異氟醚(CAS26675-46-7,批號:54832601)購自美國MERCK公司,大鼠IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司,批號分別為T1568、T1840、T3349,蘇木精-伊紅(HE)染色試劑、末端標記法(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL)細胞凋亡檢測試劑盒、蛋白裂解液均上海碧云天生物技術有限公司,批號分別為20200518、20210130、20210210,含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteine proteinase-3,caspase-3)、caspase-9、SIRT1、NF-κB、磷酸化(phosphorylated,p)-NF-κB、NF-κB抑制蛋白(NF-κB inhibitory protein,IκBα)、β-肌動蛋白(β-actin)抗體均購自美國Abcam公司,批號分別為ab32499、ab32539、ab110304、ab209795、ab28849、ab183503、ab8226。

1.3 實驗動物 40只SPF級SD大鼠購于川北醫學院動物實驗中心,雄性,6～8周齡,體質量200～250 g,動物生產合格證編號為SCXK(川)2018-0018。大鼠飼養于溫度為22～25 ℃、相對濕度為40%～60%的動物房,光照和黑暗每12 h交替,適應環境飼養3 d再正式進入實驗。本研究經我院動物倫理委員會批準(批準號:202219)。

1.4 動物分組與處理 將40只SD大鼠隨機分為4組:Sham組,不做任何處理;ISO組,持續4 h吸入1.4%異氟醚[7];5 Dex Iso組,吸入異氟醚前30 min腹腔注射5 mg/kg地塞米松[6];10 Dex Iso組,吸入異氟醚前30 min腹腔注射10 mg/kg地塞米松[6],每組10只。麻醉過程中注意觀察大鼠呼吸情況,防止發生呼吸抑制,其中異氟醚吸入后大鼠翻正反射消失即為麻醉成功。麻醉大鼠結束后需要繼續吸入2 L/min的氧氣,待其恢復翻正反射,再放入各自籠中。

1.5 大鼠行為學觀測 大鼠麻醉3 d后進行Morris水迷宮實驗和物體位置識別實驗。Morris水迷宮實驗:定位航行實驗,第1至5天,每天固定時間,將大鼠從任一點面向池壁放入水池,記錄120 s內大鼠找到平臺的時間(逃避潛伏期);空間探索實驗,第6天撤除平臺,將大鼠從任一點面向池壁放入水池,記錄120 s內大鼠在原平臺位置穿越的次數。物體位置識別實驗:將A、B兩個物體放在一側壁的左右兩端,大鼠背朝兩物體放入場地內,記錄10 min內大鼠與這兩個物體接觸的情況,結束后立即將大鼠放回原來飼養的鼠盒內,待大鼠休息1 h后再進行測試,這時將場地內物體移到新的位置,仍將大鼠背向兩物體放入,記錄5 min內大鼠對物體的探索時間(物體記憶時間)。

1.6 大鼠海馬組織病理染色 行為學觀測結束后處死大鼠,采集腦組織,分離海馬組織,部分固定于4%多聚甲醛溶液,制備石蠟組織切片,分別行HE染色和TUNEL染色,觀察海馬區形態學變化和細胞凋亡情況。

1.7 ELISA 檢測大鼠海馬組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平 取海馬組織,混入預冷生理鹽水制備海馬組織勻漿液,4 ℃下5 000 r/m離心10 min分離上清液,參照酶聯免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒說明書操作,檢測海馬組織中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

1.8 Western blot法檢測大鼠海馬組織相關蛋白表達量 采用取海馬組織,加入蛋白裂解液提取總蛋白,采用二喹啉甲酸法(bicinchoninic acid,BCA)法檢測蛋白濃度,再經過聚丙烯酰胺凝膠電泳至蛋白完全分離,以300 mA恒流轉移至聚二偏氟乙烯(polyvinylidenefluoride,PVDF)膜,5%脫脂牛奶中封閉2 h,然后分別孵育caspase-3、caspase-9、SIRT1、NF-κB、p-NF-κB、IκBα及β-actin抗體,稀釋比均為1∶1 000,4 ℃下搖床過夜,次日取出洗膜5次(8 min/次),再孵育二抗,稀釋比為1∶5 000,37 ℃下搖床孵育1 h,最后暗室發光顯影。

2 結果

2.1 4組大鼠行為學檢測數據的比較 與Sham組比較,ISO組第3至5天逃避潛伏期和物體記憶時間延長,原平臺位置穿越次數減少(P<0.05);與ISO組比較,10 Dex Iso組第4至5天逃避潛伏期和物體記憶時間縮短,原平臺位置穿越次數增加(P<0.05),且10 Dex Iso組第5天逃避潛伏期和物體記憶時間短于5 Dex Iso組,原平臺位置穿越次數多于5 Dex Iso組(P<0.05)。見表1。

表1 4組逃避潛伏期、原平臺位置穿越次數和物體記憶時間的比較

2.2 4組大鼠海馬組織形態學變化的比較 Sham組大鼠海馬區細胞形態規則、排列整齊,細胞核染色均勻;ISO組海馬區細胞核存在不同程度的固縮深染與空泡化,排列雜亂,10 Dex Iso組病理損傷較ISO組、5 Dex Iso組輕微,見圖1。

圖1 4組大鼠海馬組織HE染色形態學變化的比較(400×)

2.3 4組大鼠海馬組織神經元凋亡情況的比較 與Sham組比較,ISO組海馬組織神經元凋亡率、caspase-3及caspase-9相對表達量明顯升高(P<0.05);與ISO組比較,10 Dex Iso組神經元凋亡率、caspase-3及caspase-9相對表達量明顯降低(P<0.05),且10 Dex Iso組上述指標低于5 Dex Iso組(P<0.05)。見圖2、3,表2。

圖2 4組海馬組織神經元TUNEL染色凋亡情況(200×)

圖3 4組海馬組織凋亡蛋白的表達

表2 4組海馬組織神經元凋亡率和凋亡蛋白表達量的比較

2.4 4組大鼠海馬組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平的比較 與Sham組比較,ISO組海馬組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高(P<0.05);與ISO組比較,10 Dex Iso組IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯降低(P<0.05),且10 Dex Iso組上述指標低于5 Dex Iso組(P<0.05)。見表3。

表3 4組海馬組織IL-6、IL-1β和TNF-α水平的比較

2.5 4組大鼠海馬組織SIRT1/NF-κB信號通路蛋白表達量的比較 與Sham組比較,ISO組海馬組織SIRT1和IκBα表達量明顯降低,p-NF-κB/NF-κB水平明顯升高(P<0.05);與ISO組比較,10 Dex Iso組SIRT1和IκBα表達量明顯升高,p-NF-κB/NF-κB水平明顯降低(P<0.05),且10 Dex Iso組SIRT1和IκBα表達量高于5 Dex Iso組,p-NF-κB/NF-κB水平低于5Dex Iso組(P<0.05)。見圖4、表4。

圖4 4組海馬組織SIRT1/NF-κB信號通路蛋白的表達

表4 4組大鼠海馬組織SIRT1/NF-κB信號通路蛋白表達量比較

3 討論

隨著醫學技術的不斷發展與進步,全身麻醉或監測麻醉下手術、有創檢查的病例越來越多,雖然麻醉的介入大幅提高患者的舒適度與配合度,但麻醉藥物導致其行為異常也時有發生。研究表明,異氟醚可介導炎癥反應[8]、氧化應激[9]、細胞凋亡[10]等多種途徑損害腦組織,影響腦功能。地塞米松屬于長效糖皮質激素,除具有強效的抗炎作用外,還可逆轉空間記憶障礙、減輕神經元細胞病理變化:馮安琪等[11]對300例接受單側全髖/膝關節置換術的老年患者予以不同劑量的地塞米松,發現0.15 mg/kg地塞米松可降低患者術后認知功能障礙的發生率,可能與改善血清TNF-α、中樞神經特異蛋白、神經元特異性烯醇化酶水平有關;Jeong等[12]發現,過度和長期的神經炎癥會導致創傷性腦損傷后的神經元細胞死亡,水凝膠介導的地塞米松局部注射可減輕創傷性腦損傷后的神經炎癥。本研究采用Morris水迷宮實驗和物體位置識別實驗評估實驗動物空間學習能力與記憶能力,發現異氟醚持續吸入會延長大鼠逃避潛伏期和物體記憶時間,并減少大鼠穿越原平臺的次數,表明異氟醚會減弱大鼠空間學習能力和參考記憶力。與ISO組比較,5 Dex Iso組各指標無明顯差異,10 Dex Iso組第4至5天逃避潛伏期和物體記憶時間縮短,原平臺位置穿越次數增加,且10 Dex Iso組第5天逃避潛伏期和物體記憶時間短于5 Dex Iso組,原平臺位置穿越次數多于5 Dex Iso組,提示地塞米松作用與其濃度有關,10 mg/kg地塞米松可部分逆轉異氟醚麻醉引起的大鼠認知功能損傷。本研究在明確地塞米松可提升動物高級腦功能的基礎上,對其分子作用機制作進一步分析。

有文獻報道,地塞米松可改善腦組織病理損傷[13-14]。本研究通過對海馬組織進行HE染色結果顯示,與Sham組比較,吸入異氟醚后大鼠海馬區細胞核存在不同程度的固縮深染與空泡化,排列雜亂,而注射10 mg/kg地塞米松干預后,上述病理損傷明顯減輕。TUNEL染色結果顯示,地塞米松可減輕異氟醚所致海馬神經元凋亡,通過檢測海馬組織內caspase-3和caspase-9蛋白表達,結果顯示,異氟醚暴露前給予地塞米松可顯著降低caspase-3和caspase-9表達,抑制神經元凋亡,與Skelly等[15]報道地塞米松可抑制腦神經元凋亡,從而改善記憶功能障礙的作用相符,這可能是地塞米松對異氟醚致大鼠認知功能障礙的治療作用機制之一。

SIRT1在細胞生長、代謝、應激及炎癥反應等多種病理生理過程中均有重要的調控作用,主要依賴對底物的去乙酰化修飾作用[16-17]。研究顯示,SIRT1可去乙酰化修飾NF-κB亞基P65的Lys310殘基,抑制NF-κB的轉錄活性,負向調控炎癥反應,減少IL-6、IL-1β和TNF-α等炎性因子和促凋亡基因表達[18-19]。Tang等[20]研究發現,通過調節小膠質細胞SIRT1/NF-κB通路可改善七氟醚暴露小鼠的認知功能損害。還有研究[6]顯示,地塞米松可能通過促進SIRT1表達,維持線粒體正常代謝,實現對七氟烷麻醉致新生大鼠神經元損傷的保護。本研究觀察到ISO組大鼠海馬組織中SIRT1和IκBα表達量明顯減少,p-NF-κB/NF-κB、IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯升高,5 Dex Iso組和ISO組各指標無明顯差異,而10 Dex Iso組較ISO組和5 Dex Iso組SIRT1和IκBα表達量增加,p-NF-κB/NF-κB、IL-6、IL-1β和TNF-α水平降低,表明10 mg/kg地塞米松可能通過上調SIRT1和IκBα表達,抑制NF-κB磷酸化,從而抑制NF-κB介導的炎癥反應。

4 結論

10 mg/kg地塞米松可改善異氟醚麻醉所致大鼠認知功能障礙,減輕神經元凋亡,可能與調節SIRT1/NF-κB信號通路有關。本研究結果為地塞米松在術后認知功能障礙中的應用提供了實驗依據,未來將深入分析地塞米松在腦神經元保護中的作用機制。