山茶花提取物抑制膠質瘤細胞SW1088增殖、遷移和侵襲的機制研究*

程鈴 陳蓉 李朝今 曾力楠

(1.三六三醫院藥劑科,四川 成都 610000;2.四川大學華西第二醫院藥劑科,四川 成都 610041)

膠質瘤是一種起源于神經膠質細胞的顱內腫瘤,是中樞神經系統中最常見的惡性腫瘤,其治療方式主要有手術切除,并加以結合放療或化療,但治療效果欠佳,易出現復發等情況[1]。因此,尋找治療膠質瘤的藥物具有重要意義。山茶花具有調胃、理氣、散於等功效[2]。有研究顯示,山茶花揮發油對宮頸癌細胞Hela、肝癌細胞HepG2的增殖有抑制作用,且呈劑量和時間依賴性[3]。然而,關于山茶花提取物對膠質瘤細胞的影響與機制尚不清楚。據報道,在膠質瘤中miR-526b-3p表達降低,其表達與分級、KPS評分及較差的預后有關,過表達miR-526b-3p能抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲[4]。磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinaseB,AKT)信號通路是經典的信號轉導途徑,PI3K、AKT磷酸化后能調節膠質瘤細胞生物學過程[5]。研究顯示,青藤堿酯衍生物可通過抑制PI3K/AKT信號通抑制膠質瘤細胞增殖和誘導凋亡[6]。本研究以膠質瘤細胞SW1088為研究對象,探究山茶花提取物是否能夠通過調控miR-526b-3p/PI3K/AKT信號通路影響膠質瘤細胞的惡性生物學行為。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑 山茶花購于浙江省大洋山,75%乙醇購于北京伊塔生物科技有限公司,山茶花提取物使用乙醇提取法進行提取。膠質瘤細胞SW1088購于中國科學院上海細胞庫,胎牛血清、DMEM培養基來源于美國的Hyclone公司,Lipofectamine 2000試劑盒來源于美國Invitrogen公司,模擬物陰性對照(miR-NC)、miR-526b-3p模擬物(miR-526b-3p)、抑制物陰性對照(anti-miR-NC)、miR-526b-3p抑制物(anti-miR-526b-3p)、引物購于廣州銳博生物科技有限公司,MTT試劑盒、Transwell、BCA試劑盒、ECL試劑購于北京索萊寶公司,基質膠Matrigel購于美國BD公司,細胞周期素D1(CyclinD1)抗體、基質金屬蛋白酶2(MMP2)抗體、基質金屬蛋白酶 9(MMP9)抗體、磷酸化的PI3K(p-PI3K)抗體、磷酸化的AKT(p-AKT)抗體、β-肌動蛋白(β-actin)抗體購于英國Abcam公司,羊抗兔IgG二抗、Trizol試劑盒、TaqMan MicroRNA試劑盒、熒光定量試劑盒購于美國Thermo Fisher公司。

1.2 細胞分組 膠質瘤細胞SW1088在含有10%胎牛血清的DMEM培養基中培養,在5% CO2環境中進行細胞培養,對應溫度為37 ℃。收集對數期SW1088細胞接種6孔板中,將山茶花提取物濃度為30、60、120 mg/L處理細胞,分別記為低劑量組、中劑量組、高劑量組,以正常培養SW1088細胞作為對照組;按照脂質體法將miR-NC、miR-526b-3p轉染SW1088細胞中,分別記為miR-NC組、miR-526b-3p組;將anti-miR-NC、anti-miR-526b-3p轉染至SW1088細胞中,加入高劑量山茶花提取物,分別記為anti-miR-NC+高劑量組、anti-miR-526b-3p+高劑量組。細胞轉染以Lipofectamine 2000試劑盒作為參照,細胞培養48 h進行實驗。

1.3 qRT-PCR檢測miR-526b-3p相對表達量 利用Trizol試劑分離各組SW1088細胞中總RNA,RNA濃度、純度檢測后,借助TaqMan MicroRNA試劑盒,將其反轉錄合成cDNA,以cDNA為模板,用熒光定量試劑盒進行擴增反應。反應體系為10 μL的2×TransStart?Green qPCR SuperMix,正、反引物各0.5 μL,cDNA模板2 μL,RNase-Free H2O補充至20 μL。以U6做內參基因,使用2-△△CT計算miR-526b-3p相對表達量。

1.4 MTT檢測細胞增殖活性 將SW1088細胞收集起來,接種在96孔板中,并依據1.2法處理后培養48 h時,加入5 mg/mL(20 μL)的MTT溶液,繼續培養4 h,每孔內加150 μL的二甲基亞砜溶液,結晶完全溶解后,借助酶標儀于490 nm處,對細胞吸光度值(A)進行檢測。

1.5 細胞遷移及侵襲檢測遷移和侵襲能力 遷移實驗:以Transwell進行檢測,將各組SW1088細胞實驗中未含血清的完全培養基收集起來,其細胞密度對應3×105個/mL,分別在Transwell上室、下室加細胞懸液、含血清的完全培養基,劑量分別對應100、500 μL,于培養箱中培養24 h,取出小室,將未遷移的細胞輕輕擦掉,多聚甲醛固定細胞、結晶紫染色,時間分別為30、20 min,倒置顯微鏡觀察細胞遷移數量。侵襲實驗:按比例將基質膠Matrigel、培養基稀釋,再取50 μL鋪于Transwell上室,凝固5 h之后,后續的實驗步驟同遷移實驗一致。

1.6 Western blot檢測CyclinD1、MMP2、MMP9、p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平 收集各組SW1088細胞在PBS內洗2次,加蛋白裂解試劑進行裂解細胞,BCA試劑盒進行檢測定量,以10% SDS-PAGE將蛋白樣品分離,半干法轉膜,室溫下以脫脂奶粉封閉培養,時間為2 h,分別加CyclinD1(1:600)、MMP2(1:600)、MMP9(1:600)、p-PI3K(1:800)、p-AKT抗體(1:800),4 ℃條件下,過夜孵育,第二日室溫下孵育帶有標記的羊抗兔IgG二抗(1:3000),時間為2 h,使用ECL試劑顯色,曝光。使用Image-J軟件分析蛋白條帶密度值,以GAPDH做內參基因。其中p-PI3K、p-AKT抗體只檢測對照組、高劑量組、anti-miR-NC+高劑量組、anti-miR-526b-3p+高劑量組。

2 結果

2.1 不同濃度山茶花提取物提高miR-526b-3p表達 與對照組相比,低劑量組、中劑量組、高劑量組SW1088細胞中miR-526b-3p相對表達量增加,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同濃度山茶花提取對miR-526b-3p表達的影響

2.2 不同濃度山茶花提取物抑制SW1088細胞增殖、遷移和侵襲 與對照組相比,低劑量組、中劑量組、高劑量組SW1088細胞中A值降低,細胞遷移數量及侵襲數量減少(P<0.05)。見表2。

表2 不同濃度山茶花提取物對SW1088細胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.3 不同濃度山茶花提取物抑制SW1088細胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達 與對照組相比,低劑量組、中劑量組、高劑量組SW1088細胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達水平降低,差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1、表3。

圖1 不同濃度山茶花提取物對CyclinD1, MMP2和MMP9蛋白表達

表3 不同濃度山茶花提取物對CyclinD1, MMP2 and MMP9蛋白表達水平

2.4 miR-526b-3p抑制SW1088細胞增殖、遷移和侵襲 miR-526b-3p組SW1088細胞中miR-526b-3p相對表達量高于miR-NC組,細胞A值、細胞遷移數量、細胞侵襲數量,以及CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達水平均低于miR-NC組(P<0.05)。見圖2、表4。

表4 miR-526b-3p對SW1088細胞增殖、遷移和侵襲及對CyclinD1, MMP2 and MMP9蛋白表達水平的影響

2.5 anti-miR-526b-3p可以減弱山茶花提取物對SW1088細胞增殖、遷移和侵襲的影響 anti-miR-526b-3p+高劑量組SW1088細胞中miR-526b-3p相對表達量低于anti-miR-對照組+高劑量組,細胞A值、細胞遷移數量、細胞侵襲數量,以及CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白表達水平均高于anti-miR-對照組+高劑量組(P<0.05)。見圖3、表5。

圖3 CyclinD1,MMP2和MMP9蛋白表達

表5 anti-miR-526b-3p對SW1088細胞增殖、遷移和侵襲及對CyclinD1, MMP2 和 MMP9蛋白表達水平的影響

2.6 PI3K/AKT信號通路蛋白表達情況 高劑量組、anti-miR-NC+高劑量組SW1088細胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平較對照組降低(P<0.05);anti-miR-526b-3p+高劑量組SW1088細胞p-PI3K、p-AKT蛋白表達水平較anti-miR-NC+高劑量組升高(P<0.05)。見圖4、表6。

圖4 PI3K/AKT信號通路蛋白表達情況

表6 PI3K/AKT信號通路蛋白表達情況

3 討論

膠質瘤是神經外科最常見的惡性腫瘤,與基因突變、遺傳因素及環境因素有關,其發病率相對較低,但病死率、復發率高,治療效果仍不理想[7]。雖然目前膠質瘤治療模式多樣,但是患者預后生存期限并未顯著提高[8]。近年的研究顯示,天然藥物在治療腫瘤上顯現出獨特優勢[9],如毛蕊花糖苷呈劑量效應關系抑制膠質瘤細胞增殖和侵襲,及上皮間質轉化[10]。另有研究發現,蘆薈大黃素能抑制膠質瘤細胞增殖、侵襲和遷移,阻滯周期在S期[11]。白頭翁皂苷D具備抑制膠質瘤細胞有遷移、侵襲的作用,且能有效加速細胞凋亡進程[12]。山茶花有抗炎、抗氧化及抗腫瘤等藥理活性[13-14]。本研究結果顯示,不同濃度山茶花提取物對膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲發揮良好的抑制作用。CyclinD1蛋白是特異性的周期蛋白,與細胞生長分化有關,將細胞周期從G1期加速轉向S期,繼而使細胞增殖進程加快[15]。MMP2、MMP9為基質金屬蛋白酶,其作用包括參與細胞外基質和基底膜降解過程,并加快腫瘤細胞遷移、侵襲進展[16]。本研究發現,山茶花提取物能降低膠質瘤細胞中CyclinD1、MMP2、MMP9蛋白水平,且劑量依賴性,說明山茶花提取抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲,可能與降低CyclinD1、MMP2、MMP9有關。

研究顯示,在肝癌細胞中miR-526b-3p表達降低,其過表達能靶向抑制TNKS2進而抑制肝癌細胞增殖、遷移和侵襲[17]。據報道,miR-526b-3p在膠質瘤中表達降低,上調miR-526b-3p可抑制膠質瘤細胞增殖、遷移和血管形成[18]。還有研究發現,miR-526b-3p可通過下調IGF2BP1抑制膠質瘤細胞增殖和誘導凋亡[19]。本研究結果顯示,山茶花呈劑量依賴性增加miR-526b-3p表達量,提示山茶花提取物可能調控miR-526b-3p表達。將過表達miR-526b-3p轉染膠質瘤細胞后,miR-526b-3p表達上調,膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲能力均被抑制。另外,在高劑量山茶花提取物干預的基礎上,下調miR-526b-3p表達能逆轉高劑量山茶花提取物對膠質瘤細胞增殖、遷移和侵襲的影響,提示山茶花提取可能調控miR-526b-3p表達影響膠質瘤細胞發展。PI3K/AKT信號通路能調節多種生物學過程,如增殖、遷移、侵襲等,進而參與膠質瘤的發展[20]。文獻報道,PI3K/AKT信號通路激活受到抑制,也會對膠質瘤細胞的增殖、遷移、侵襲產生抑制作用[21]。在本研究中,高劑量山茶花提取物降低p-PI3K、p-AKT蛋白表達,將anti-miR-526b-3p轉染細胞后加高劑量山茶花提取后,p-PI3K、p-AKT蛋白表達上調,說明PI3K/AKT信號通路與山茶花提取調控miR-526b-3p影響膠質瘤細胞發展的有關。

4 結論

山茶花提取物可抑制膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲,作用機制可能與miR-526b-3p/PI3K/AKT信號通路有關。關于山茶花提取物與PI3K/AKT信號通路對膠質瘤細胞具體研究作用需要后一步實驗研究。