尿毒素硫酸吲哚酚通過OAT-3誘發HK-2細胞纖維化的作用*

阿孜古力·克熱木 艾克拜爾·吾曼爾 麥伍拉尼·馬木提 買買提·依斯熱依力 王晨宇 李九智

(1.新疆維吾爾自治區人民醫院臨床檢驗中心,新疆 烏魯木齊 830001;2.新疆維吾爾自治區人民醫院泌尿中心,新疆 烏魯木齊 830001;3.新疆醫科大學第七附屬醫院泌尿外科,新疆 烏魯木齊 830028;4.新疆維吾爾自治區人民醫院醫學研究與轉化中心,新疆 烏魯木齊 830001)

尿毒癥毒素是慢性腎臟病(Chronic kidney disease, CKD)患者尤其是終末期腎病患者因腎功能減退、腎清除率下降導致在血液中不斷蓄積的有毒物質。硫酸吲哚酚(Indoxyl Sulfate,IS)是近年來發現的蛋白結合性尿毒素,不容易被透析方式排出,在尿毒癥期其血液濃度持續增高,給腎臟及血管系統帶來了毒性作用[1]。有機陰離子轉運蛋白-3(Organic anion transporter-3,OAT-3)是體內主要的IS轉運因子[2],對其進行研究不僅可進一步了解CKD患者IS高水平的發生機制,并且可以為新型藥物研制提供一定的實驗依據。NADPH氧化酶-4(Nox-4)被認為是機體內重要的氧化應激指標,也是IS促進CKD發生發展的分子機制之一,能激活細胞內多種信號傳導通路,其異?；罨艽龠M腎功能衰退和腎纖維化病變[3]。腎纖維化是CKD進行性發展至終末期腎功能衰竭的病理標志,其相關的分子機制仍未探明,尤其CKD中IS誘發腎纖維化的分子機制有待進一步探究。因此,本文通過體外培養人正常腎小管上皮(HK-2)細胞實驗,探討IS能否通過OAT-3以及氧化應激,促進腎纖維化的發生。利用siRNA沉默OAT-3和抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預處理的HK-2細胞中分析氧化應激(Nox-4)及纖維化因子(Collagen I、TGF-β1、Smad-3、α-SMA)的mRNA和蛋白表達情況,進一步明確OAT-3敲低和NAC預處理對上述指標的作用,以期為今后進一步探索提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 人正常腎小管上皮細胞系HK-2購自武漢普諾賽生命科技有限公司,DMEM培養基、胎牛血清均購自美國Gibco公司,青鏈霉素、RIPA細胞裂解液及N-乙酰半胱氨酸(NAC)購自北京索萊寶科技有限公司,LipofectamineTM3000購自美國Invitrogen公司,siRNA購于上海吉瑪公司,TRIzol試劑、引物及蛋白裂解液等試劑購于天根生化科技(北京)有限公司,Nox-4、Collagen I、TGF-β1、α-SMA、Smad-3等抗體均購自美國abcam公司,OAT-3、山羊抗鼠二抗和山羊抗兔二抗均購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 參考我們前期研究[4],大體步驟:將復蘇的HK-2細胞接種于10 cm2培養皿,用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素以及100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640高糖DMEM培養基放在37 ℃、5% CO2培養箱中培養,24 h后首次換液,以后48 h換液1次;待細胞生長達到80%～90%匯合時,進行傳代;第2～8代細胞用于后續的實驗。

1.2.2 實驗分組 HK-2細胞用0.25%胰酶消化,傳代后隨機分為兩組:①空白對照組(Control組):加入培養液中正常培養不予干預。②IS處理組(IS組):加入含250 μmoL IS培養。HK-2細胞貼壁生長,排列緊密,見圖1。兩組均培養24 h后,用PBS清洗細胞2次,加入TRIzol裂解液,取總RNA,采用RT-PCR方法檢測氧化應激(Nox-4)及纖維化因子指標的mRNA相對表達水平。

圖1 Control組和IS組HK-2細胞鏡下觀察(200×)

1.2.3 細胞轉染 HK-2細胞培養于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素以及100 μg/mL鏈霉素的RPMI-1640高糖DMEM培養液進行培養,以5×106/孔的密度接種于6孔板中,待細胞密度達到70%～90%時準備轉染;將LipofectamineTM3000與siRNA(OAT-3基因序列為5′-CACCTTTGTGCCCTTGGAUdTdT-3′,OAT-3 siRNA終濃度為10 nmol/L)稀釋于基礎培養基中,混勻后靜置5 min,再將兩者混合并室溫靜置20 min,使之充分混勻;最后將上述混合液加入6孔板,置于37 ℃、5%CO2培養箱中培養48 h進行后續實驗,進一步分為Control組、IS組、陰性對照組(si-OAT-3組)、si-OAT-3+IS組(si-OAT-3+IS組)均培養24 h后,用PBS清洗細胞2次,加入TRIzol裂解液,取總RNA,采用RT-PCR方法做后續檢測。

1.2.4 抗氧化劑預處理實驗 HK-2細胞進一步分為Control組、IS組以及NAC+IS組。NAC+IS組需要加入1 mmol/L抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)并孵育4 h后,加入IS刺激HK-2細胞孵育24 h。3組棄去培養液,用PBS清洗細胞2次,加入TRIzol裂解液,取總RNA,采用RT-PCR方法檢測氧化應激(Nox-4)及纖維化因子指標的mRNA相對表達水平。

1.2.5 實時定量RT-PCR檢測OAT-3、Nox-4、Collagen I等mRNA表達水平 參考我們前期研究[5],采用實時定量(Reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)測定空白對照組、IS組、siOAT-3組以及NAC與處理組HK-2細胞中OAT-3、Nox-4、Collagen I、TGF-β1、α-SMA、Smad-3的mRNA表達。目的基因和GAPDH管家基因引物序列見表1。RT-PCR反應嚴格按照試劑盒操作說明進行,應用2-△△CT計算出目標基因的相對表達水平。

表1 基因引物序列

1.2.6 Western blot檢測OAT-3、Nox-4、Collagen I等蛋白表達水平 參考我們前期研究[4],各組HK-2細胞培養皿中加入蛋白裂解液(50 mmol/L PIPA)裂解細胞,提取蛋白質,其濃度測定使用采用BCA試劑盒。上樣每孔加入20 μg蛋白,聚丙烯酰胺凝膠電泳后,轉移至聚偏二佛乙烯(PVDF)膜上,封閉,洗膜后加一抗(1∶1000)4 ℃過夜,然后用1×TBST洗膜3次 5 min,再與二抗(1∶10000)室溫孵育1 h,在用1×TBST洗膜3次 5 min,β-actin作為內參照。置于凝膠成像儀中照相并應用Image J軟件對目的蛋白質條帶灰度進行分析。

2 結果

2.1 IS誘導HK-2細胞氧化應激及纖維化因子的高表達 與Control組比較,IS顯著增加氧化應激(Nox-4)及纖維化因子(Collagen I、TGF-β1、Smad-3、α-SMA)的mRNA表達水平(t分別為3.778、4.649、7.677、7.677、3.929,均P<0.05),見圖2。提示IS顯著誘導HK-2細胞氧化應激及纖維化指標的高表達。

圖2 IS誘導氧化應激及纖維化因子指標mRNA水平的高表達

2.2 敲低OAT-3阻斷IS誘導HK-2細胞氧化應激及纖維化因子的高表達 為了檢測OAT-3轉染效率,我們將si-RNA陰性對照和si-OAT-3轉染到HK-2細胞,培養48 h后,加入IS刺激24 h后分別提取總RNA進行分析。結果顯示,HK-2細胞中敲低OAT-3抑制其mRNA表達(F=112.6,P<0.05),見圖3;si-OAT-3組和si-OAT-3+IS組均顯著降低氧化應激(Nox-4)及纖維化因子(Collagen I、TGF-β1、Smad-3、α-SMA)的mRNA以及蛋白表達水平顯著低于IS組(F分別為61.21、75.02、93.99、65.04、126.20,均P<0.05),見圖4。提示敲低OAT-3阻斷IS誘導氧化應激及纖維化因子的高表達。

圖3 敲低OAT-3抑制其mRNA及蛋白表達水平

圖4 敲低OAT-3阻斷IS誘導HK-2細胞氧化應激及纖維化因子的高表達

2.3 抗氧化劑NAC抑制HK-2細胞氧化應激及纖維化因子的高表達 最終HK-2細胞以抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)預處理后,加入250 μmoL濃度的IS刺激24 h后,分別采用RT-PCR及Western blot方法檢測上述指標的mRNA和蛋白表達水平。結果顯示,NAC顯著抑制IS誘導氧化應激(Nox-4)及纖維化因子(Collagen I、TGF-β1、Smad-3、α-SMA)的mRNA及蛋白的表達水平(F分別為16.83、171.40、49.61、62.12、45.25,均P<0.05),見圖5。提示NAC有效抑制IS誘導氧化應激及纖維化因子的高表達。

圖5 NAC抑制HK-2細胞氧化應激及纖維化因子的mRNA及蛋白水平的高表達

3 討論

尿毒癥期患者體內各種尿毒素的蓄積可加速腎衰并引起腎和心血管系統的并發癥。依據尿毒素與蛋白質結合的能力,尿毒素可分為蛋白質結合型毒素和非蛋白質結合型毒素。現有的透析方法能除去大部分非蛋白質結合型毒素,卻對蛋白質結合型毒素無能為力[6-7]。近些年來在尿毒癥領域被廣泛關注的IS是一種由色氨酸衍生物代謝生成的蛋白結合型毒素,由吃下的食物分解出的色氨酸在腸道中被腸內菌如大腸桿菌的色氨酸酶分解為吲哚,再被腸黏膜吸收,經門靜脈系統進入肝臟,在肝細胞中經羥化作用和硫酸鹽化形成IS[8]。正常人體中IS主要通過尿液排出體外,腎臟腎小管細胞上高表達的有機陰離子轉運體(OATs)能介導IS的攝取。當腎實質性損傷時,功能性腎小管細胞急劇減少,于是IS大量蓄積于人體血液中;隨著CKD進展,患者血液中IS的含量持續增加[9-10]。不管是血液透析還是腹膜透析都無法有效地去除IS,原因在于大部分IS都以蛋白結合形式存在于血液中,而結合后的化合物直徑大于透析膜孔徑,從而難以清除。

研究發現,在5/6切除的小鼠腎衰模型中IS是誘導腎功能衰竭及腎纖維化加重的尿毒素,而腎衰的同時使得IS在體內進一步蓄積,其水平上升,兩者相互促進形成惡性循環[11-12]。OAT-3主要分布于腎臟、心血管及腦組織,但在腎臟中的分布量最多[12]。IS在腎臟中的排泄與腎近端小管上皮細胞中OAT-3密切有關。IS經OAT-3進入細胞內并引起細胞內氧化和抗氧化平衡的失衡,使得氧化應激過量產生在腎小管和腎小球的基質細胞中升高轉化生長因子β1以及膠原蛋白等的表達,加速腎小球硬化從而加速腎衰竭[13-15]。在大鼠腎衰竭模型中IS通過OAT-3攝取進入平滑肌細胞內并引導氧化應激的產生,激活芳香烴受體和NF-κB等細胞信號傳導系統,從而誘導血管平滑肌細胞的增殖以及血管鈣化等病變[16]。本研究中,IS刺激體外培養HK-2細胞中氧化應激及纖維化因子的高表達;敲低OAT-3能夠阻斷IS誘導氧化應激及纖維化因子的高表達,提示阻斷IS經OAT-3攝取入腎小管上皮細胞能夠抑制纖維化的發生。

纖維化作為許多慢性炎癥性疾病最終的病理變化,其主要的改變為纖維結締組織過度積累于炎癥或損傷的組織內或周圍,引起永久性瘢痕、器官結構破壞及功能不全,乃至死亡[17-20]。纖維化的發生與炎癥反應、氧化應激、TGF-β/Smad信號通路、Wnt/β-catenin信號通路及脂代謝相關,其中與TGF-β/Smad信號通路之間的關系較為密切[21]。IS在細胞和組織內通過不同途徑影響機體氧化/抗氧化系統,并導致該系統的紊亂,從而引起氧化應激的產生[22]。NADPH為細胞內一組具有氧化活性的酶復合體,并由六種不同的亞基構成,其中Nox-4是與活性氧關系最密切的氧化酶[23-25]。氧化應激與TGF-β在促進組織纖維化中的相互作用亦得到證實,即TGF-β的活化引起細胞內氧化應激產生;同時,氧化應激同樣刺激潛在的TGF-β形成纖維化[26-27]。本研究結果顯示,NAC有效抑制IS誘導氧化應激及纖維化因子的高表達,提示IS經OAT-3攝取到HK-2細胞內,進而增加氧化應激,最終促進纖維化因子的高表達。

IS是蛋白質結合型的尿毒素,透析治療使其排出體外十分困難,因此加深對IS的認識及其作用機制至關重要。本研究探討了IS在HK-2細胞中通過OAT-3和氧化應激促進纖維化發生的分子機制,然而其更深入機制以及相關的阻斷IS的毒性作用和尋找有效的抑制劑方面(如OAT-3抑制劑或抗氧化劑)的研究有待進一步探索。

4 結論

IS經OAT-3攝取到HK-2細胞內,進而增加氧化應激,促進纖維化因子的高表達;敲低OAT-3和抗氧化劑NAC的使用能有效阻斷IS誘導腎小管上皮纖維化的發生。