厚胞湯治療宮腔粘連的網絡藥理學與分子對接研究

王涵芝 駱詩靈 瞿思穎 柯歡笑 蕭凡清 李心悅 王琳 趙宏利*

宮腔粘連（IUA）是由于子宮內膜基底層受損導致纖維組織形成，間質組織消失，組織間橋跨越子宮壁的各個方向，形成粘連［1-2］。IUA 患者常出現月經稀發、閉經、子宮內膜薄、反復流產，甚至可發生不孕［3-4］。IUA 的發病率1.7%～45.5%［5］，嚴重影響女性的生理心理健康。研究認為腎虛血瘀是IUA 主要的病機，治法為補腎活血［6］。趙宏利主任醫師提出IUA“通補奇經法”的治療，創立中藥復方“厚胞湯”。臨床上常用網絡藥理學來進行相關機制探討［7-9］，本研究應用網絡藥理學和分子對接，對厚胞湯進行靶標預測、功能富集，篩選出與IUA 相關的活性成分、闡釋其作用機制。

1 材料與方法

1.1 厚胞湯成分靶點信息 使用Batman-TCM 數據庫［10］（http：//bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）檢索出所有中藥化合物和靶點，從而了解其功能和作用機制，選取得分＞20 分納入。經Uniprot 數據庫［11］校正，去掉非人類靶點。

1.2 IUA 靶點 在GeneCards［12］（https：//www.genecards.org/）、NCBI［13］（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 以及DisGeNET（https：//www.disgenet.org/）三個數據庫以“Intrauterine adhesion”為關鍵詞進行人類基因檢索［14］。其中，GeneCards 數據庫通過對得分的中位值篩選，選出更加相關的靶點。

1.3 韋恩圖 通過venny2.1 軟件，將檢測出的藥物靶點和病變靶點加以結合，以獲得共有靶點，并利用這些靶點來預測厚胞湯對IUA 的影響，從而實現作用通路的分析。

1.4 PPI 網絡的構建 通過將疾病及藥物的409 個共有靶點輸入到數據庫String［15］中，并且將“生物種類”選擇為“Homo sapiens”，達到0.9 以上的可信度，就可以構造出一個PPI 網絡系統。

1.5 拓撲分析 將PPI 網絡插入到Cystoscape 3.8.0［16］中，應用NetworkAnalyzer 開展相關的拓撲分析，并且結合基因的degree 排序，從而確定出得分高于平均水平的基因成為重要靶點，構建相關圖。

1.6 GO 富集分析 通過對藥物疾病共同靶點進行的GO 生物過程、分子功能和細胞組分的富集分析。且利用String 數據庫，對校正P＜0.05 的相關項目進行篩選。采用R 4.0.3 軟件，設計并引入clusterProfiler、enrichplot和ggplot2 包，創建柱狀圖，從而實現圖像的精確呈現。

1.7 KEGG 通路富集 通過KEGG 通路的富集分析方法，把藥和疾病的共同靶點進行測定，并應用String 數據庫，篩選校正P＜0.05 的項目。采用R 4.0.3 軟件配置的clusterProfiler 包，并描繪柱狀圖來進行深入研究。

1.8 成分、疾病、通路、靶點網絡構建 通過將Cytoscape3.8.0 中的成分、疾病、通路和靶點網絡文件輸入，可以更加直接揭示中醫藥活性成分在治療疾病流程中的多種作用機制，從而更好地了解其作用特征。

1.9 分子對接 蛋白質數據庫（https：//www.rcsb.org/）中的AKT1（PDB ID：4GV1），TP53（PDB ID：1JSP），CREBBP（PDB ID：7XI0），SRC（PDB ID：4U5J），JUN（PDB ID：5AEP）靶點蛋白晶體結構，用Pymol 2.1 軟件，將蛋白分子加載到AutoDock Tools-1.5.6 軟件中，對蛋白添加Gasteiger 電荷，并添加氫原子，并將原子設置為AD4 類型，保存為pdbqt 文件。化合物結構（Linoleic-Acid，Lysine，Melanin，Sebiferic-acid，Trigonelline）均來自PubChem 數據庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/），通過Chem3D 將化合物轉換為mol2 格式，并導入AutoDock Tools-1.5.6 軟件，設置好旋轉鍵，保存為pdbqt 文件。受體為五個蛋白靶點，五個化合物作為小分子配體，Grid Box 設置為40 ?x40 ?x40 ?，對接中心分別設為（AKT1：x=-26.449，y=2.715，z=16.133；TP53：x=2.407，y=11.751，z=40.92；CREBBP：x=4.231，y=-0.035，z=-18.851；JUN：x=32.391，y=13.273，z=-4.235；SRC：x=1.902，y=-37.006，z=10.763），Grid Spacing 設為0.375，AutoDock vina 進行批量分子對接，最后對結果進行評估。使用Pymol2.1 可視化物質和蛋白質之間的結合關系，2D 蛋白與小分子相互作用圖采用Discovery Studio 2019.01 軟件中的protein-ligand interction 模塊。對接算法采用Lamarckian 遺傳算法（最大值2,500 萬次能量評估，最高次數為2,000，交叉率0.8，突變率0.02，獨立對接運行100 次）的基礎研究，并通過結合自由能分析最終的對接分子。然后再根據化合物的對接分數，來確定所篩選的化合物中是否存在活性成分。

2 結果

2.1 厚胞湯成分靶點信息篩選 經匯總刪重后，化合物成分個數分別是阿膠3 個；柏子仁8 個；補骨脂14個；川牛膝3 個；當歸83 個；枸杞子46 個；龜板6個；卷柏4 個；鹿角2 個；桑葚14 個；熟地黃4 個；菟絲子1 個；王不留行3 個；澤蘭4 個。去除重復及無效值后共得到1,868 個靶點。

2.2 IUA 靶點與韋恩圖的構建 GeneCards 檢索到1,363 個靶點；NCBI 115 個靶點；DisGeNET 24 個靶點。把數據庫合并去重后，共得到1,842 個IUA 相關基因。通過將厚胞湯靶點與IUA 靶點輸入Venny 2.1 中，獲得409 個兩者共有的靶點（見圖1）。

圖1 厚胞湯-IUA交集靶點韋恩圖

2.3 PPI 網絡構建與拓撲分析 PPI 網絡由409 個節點和1,466 條邊組成，其平均度值為7.17。（見圖2-3）。經過把PPI 引入Cystoscape 3.8.0 中，采用NetworkAnalyzer相關的工具展開拓撲分析，從而甄選出106 個關鍵的靶點，并且將排序前二十個靶點用R 4.0.3 進行繪制（見圖4）。

圖2 PPI網絡互作圖A

圖3 PPI網絡互作圖B

圖4 拓撲分析圖（橫坐標為每個靶點度值）

2.4 GO 富集分析 通過引入string 數據庫，將藥物疾病的共有靶點完成GO 富集，包括生物過程、分子功能、細胞組分，并且篩選出校正P＜0.05 的項目，共富集到3,785 條生物過程，128 項分子功能相關，241 項細胞組成相關。經分析，厚胞湯改善IUA 的細胞成分為囊泡腔、膜筏、膜微域、膜區、分泌顆粒腔、細胞頂端部分、頂端質膜、內質網腔、血小板α 顆粒、細胞質囊泡腔等；生物過程包含對藥物、上皮細胞增殖、脂多糖、氧水平、細菌來源分子、上皮細胞增殖的調節、氧水平降低、活性氧代謝過程、營養水平、腺體發育等的反應；分子功能包括調節受體配體、信號受體激活、細胞因子、生長因子等活性，并與DNA 結合轉錄因子、泛素樣蛋白連接酶、細胞因子受體、RNA 聚合酶II 特異性DNA 結合轉錄因子等結合（見圖5）。

圖5 GO富集分析圖

2.5 KEGG 通路富集 通過KEGG 通路富集分析共有靶點，過濾后，富集到總共184 條信號通路。主要包括PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF 信號通路等（見圖6）。

圖6 KEGG通路富集圖

2.6 成分—疾病—通路—靶點網絡構建 用Cytoscape3.8.0 導入成分、疾病、通路和靶點，繪制出一張完整的通路網絡圖，展示出厚胞湯的活性成分在治療IUA 過程中的特性（見圖7）。

圖7 成分—疾病—通路—靶點網絡

2.7 分子對接 在分子對接中，結合能越低，親和力越高，構象越穩定，結合能＜-7.0 kcal/mol 表示兩個分子間有明顯的結合活性。結果顯示，多數化合物與靶點蛋白匹配度良好且存在較好的結合作用，綜合表現最好的是Melanin 化合物。Melanin 除與TP53外，剩余對接均＜ -7.0，其中Melanin-JUN 結合能最小，為-10.8 kcal/mol，提示化合物與靶點間具有較強的親和力。將對接后化合物與蛋白形成的復合物應用Pymol2.1 軟件進行可視化，得到化合物與蛋白的結合模式，根據結合模式可以觀察到化合物與蛋白口袋相結合的氨基酸殘基（見圖8）。Melanin 與JUN 蛋白活性口袋的VAL-863、MET-929、VAL-911、ALA-880、LEU-983 氨基酸形成較強的疏水相互作用，與GLY-993、LEU-855、LEU-932 氨基酸形成氫鍵相互作用，對穩定小分子有著重要貢獻。

圖8 JUN-Melanin分子對接

3 討論

IUA 的發病率逐年遞增，損害患者的生殖健康。此外，該病呈現高復發率的特點，臨床上宮腔鏡下粘連分離術可恢復宮腔體積和形狀，但再粘連的復發率達3%～24%［17］。因此，放置宮內節育器、導尿管球囊、透明質酸凝膠等宮腔鏡術后輔助治療應運而生，但仍有14%～48%婦女在治療后粘連復發［18-19］。因此，探索宮腔鏡下IUA 分離術后有效的輔助治療方法有助于女性健康。

厚胞湯是趙宏利主任醫師在中醫理論指導下，結合多年臨床實踐自擬的中藥復方［20］。該湯由當歸、川牛膝、王不留行、龜板、鹿角片、阿膠珠等藥材組成，方中龜板填任脈以為靜攝，鹿角走督脈以為溫煦，當歸入沖脈以為宣補，共同補養奇經，補中有動；當歸補血和血，其氣最雄，川牛膝活血下行，其勢甚健，疏通奇經瘀滯，通中有補［21］。IUA 病因多由手術損傷引起，即屬于中醫“不內外因”之“金刃”直接損傷胞宮沖任，病機為“金刃傷胞，奇經受損，瘀血內阻”，治以補助通，以通為補，通補結合，共奏通補奇經。經過本課題組的前期研究，發現厚胞湯能夠顯著提升子宮內膜厚度和容積，同時還能夠改善子宮動脈血液供應情況、提升黃體中期內膜整合素αvβ3 同時下調增生期子宮內膜相關因子的表達，臨床上常用該方提高子宮內膜容受性從而有效防治IUA 松解術后的再粘連并改善相關癥狀［22-23］。為進一步探究厚胞湯的作用機制，本研究借助網絡藥理學，剖析厚胞湯防治IUA 的關鍵作用靶點與可能作用機制。

本研究基于網絡藥理學預測厚胞湯治療IUA 的潛在機制。挖掘Batman-TCM 數據庫獲得藥物作用靶點1,868 個，挖掘3 個數據庫獲得IUA 靶點1,842 個，獲得交集靶點409 個。應用String 構建PPI，對Cystoscape行拓撲篩出106 個關鍵靶點，占總靶點數的25.9%，前20 個關鍵靶點為CREBBP、AKT1、TP53、SRC、JUN、PIK3R1、CTNNB1、HSP90AA1、MAPK14、RXRA、EGFR、ESR1、GRB2、MYC、NR3C1、TNF、SMAD3、CREB1、FOS、NCOA2。經過String 數據庫的GO 和KEGG 分析，發現厚胞湯可通過DNA 結合轉錄因子、泛素樣蛋白連接酶、RNA 聚合酶II、細胞因子受體、激素受體等，并調節受體配體、信號受體激活、細胞因子、生長因子等活性改善IUA 相關癥狀，及其主要通路可能與PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF 信號通路等相關。

TGF-β1 被認為是纖維化的中心介質，IUA 患者和動物模型中子宮內膜纖維化面積增加，同時作為纖維化標志物的TGF - β1 表達異常上調［24］，中藥可通過TGF- β1 / Smad 通路減輕IUA 大鼠子宮內膜纖維化［25］。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K / AKT）信號通路被報道可被TGF - β1 激活調節成纖維細胞反應，且有研究表明KLB 蛋白可通過激活PI3K/Akt 通路增強基質細胞增殖和細胞纖維化，從而促進IUA 的發生發展［26］，FENG 等也證明補腎活血湯可激活PI3K/Akt 通路［27］。晚期糖基化終產物（AGEs）是脂質和蛋白質與幾種氧化劑在衰老過程中發生非酶促反應的結果，RAGE 與肺纖維化過程和肺泡穩態有關，研究發現特發性肺纖維化患者的AGE-RAGE 比值增加［28］。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是一種炎性細胞因子，持續的炎癥會導致纖維化［29］。

Melanin 可參與抗炎、清除自由基、增強免疫功能等生理、病理活動［30］。研究發現，烏賊墨汁黑色素能通過改善腎組織的氧化應激，減輕腎基質間的纖維化通過介導PPAR-γ/TGF-β 代謝通路［31］。分子對接結果提示Melanin-JUN 對接良好，推測Melanin 在厚胞湯治療IUA 發揮一定調節作用。

綜上所述，基于網絡藥理學和分子對接的研究表明厚胞湯中CREBBP、AKT1、TP53、SRC、JUN、TNF、SMAD3 等可能是治療IUA 的潛在生物標志物，厚胞湯通過PI3K-Akt、AGE-RAGE、TNF 等信號通路調節纖維化、炎癥反應、氧化應激反應，本研究對厚胞湯治療IUA 進行了初步的理論探討。未來通過在細胞和動物模型中的實驗驗證來進一步補充厚胞湯對IUA 的作用機制研究。