建蘭MYB基因家族鑒定及在鹽脅迫下的表達(dá)分析

鄧文楷　彭艷　楊成　李婷婷　潘貴英

摘要：植物MYB家族是最大的轉(zhuǎn)錄因子家族，在植物脅迫反應(yīng)中起著重要作用。基于全基因組分析，對(duì)建蘭（Cymbidium ensifolium）MYB家族成員進(jìn)行鑒定和生物信息學(xué)分析，并分析相關(guān)基因在不同鹽脅迫類型下的表達(dá)情況。結(jié)果表明，從建蘭基因組中共鑒定出136個(gè)CeMYB轉(zhuǎn)錄因子，包括27個(gè)1R-MYB、102個(gè)R2R3-MYB、5個(gè)3R-MYB和2個(gè)4R-MYB。通過(guò)與擬南芥MYB進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育得到20個(gè)基因簇，表明這些CeMYB可能具有多種生物學(xué)功能。亞細(xì)胞定位、染色體定位及保守域顯示，136個(gè)CeMYB分布在18條染色體上，大多數(shù)CeMYB位于細(xì)胞核中，且具有典型的氨基酸序列重復(fù)；基序預(yù)測(cè)分析表明，多個(gè)保守元件主要位于CeMYB的N端，表明它們的功能相對(duì)保守。轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析表明，S13亞家族的CeMYB61和CeMYB89可能是調(diào)控鹽脅迫的關(guān)鍵基因，qRT-PCR驗(yàn)證進(jìn)一步表明，CeMYB61、CeMYB89在不同組織中表現(xiàn)為根系>假鱗莖>葉片>花序，其表達(dá)水平、模式與植株Na+濃度分布一致，證實(shí)CeMYB61、CeMYB89是建蘭耐受鹽脅迫的指示基因。研究為進(jìn)一步探索MYB基因的潛在機(jī)制及鹽脅迫下候選基因的挖掘提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：建蘭；MYB轉(zhuǎn)錄因子；鹽脅迫；基因組；qRT-PCR

中圖分類號(hào)：S682.310.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2023）21-0019-10

建蘭（Cymbidium ensifolium）是中國(guó)栽培歷史悠久的傳統(tǒng)蘭花種類之一，因其香氣馥郁、花姿優(yōu)美等優(yōu)點(diǎn)具有較高的觀賞價(jià)值，深受消費(fèi)者喜愛(ài)［1］。水分、溫度等環(huán)境皆會(huì)影響建蘭的生長(zhǎng)發(fā)育及體態(tài)建成［2］，且近期研究表明，由于野外氮沉降或室內(nèi)施肥方式導(dǎo)致的鹽脅迫已成為影響蘭花生長(zhǎng)與栽培的重要非生物因素［3］。在綠色植物中，鹽對(duì)植物體的影響可貫穿植物生長(zhǎng)史的各個(gè)發(fā)育時(shí)期，研究表明鹽脅迫可對(duì)葉綠體光化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生不利影響［4］，導(dǎo)致氣孔關(guān)閉、胞間CO2濃度增加，此外可導(dǎo)致離子穩(wěn)態(tài)失衡、激素代謝紊亂及DNA突變等［5］。在非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)掘候選基因和剖析信號(hào)機(jī)制，是應(yīng)對(duì)植物非生物脅迫的關(guān)鍵策略。

MYB家族是數(shù)量最多的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛分布于高等植物的基因組中；MYB家族的共同特征是具有高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，在其N末端由1～4個(gè)不完整的重復(fù)序列構(gòu)成［6］。這些重復(fù)序列包含3個(gè)保守的色氨酸殘基并編碼3個(gè)α-螺旋和1個(gè)與DNA結(jié)合的螺旋-轉(zhuǎn)角折疊結(jié)構(gòu)［7］。而C末端區(qū)域是一個(gè)高度不一致的激活域，從而廣泛調(diào)控MYB的功能表達(dá)［8］。根據(jù)MYB不完全串聯(lián)重復(fù)序列（R）的數(shù)量和位置，可將MYB家族成員分為4個(gè)亞家族，即1R-MYB蛋白（含有1個(gè)R結(jié)構(gòu)域）、R2R3-MYB蛋白（含有2個(gè)R結(jié)構(gòu)域）、R3-MYB 蛋白（包含3個(gè)R結(jié)構(gòu)域）和4R-MYB蛋白（包含4個(gè)R1和/或R2結(jié)構(gòu)域）［9］。一般來(lái)說(shuō)，具有2個(gè)重復(fù)序列的MYB成員是高等植物中的主要形式（即R2R3-MYB），同一植物的不同基因型間R2R3-MYB成員的基因拷貝數(shù)可能存在5倍差異［10］。

自植物MYB基因被表征以來(lái)，已經(jīng)在許多植物物種中發(fā)現(xiàn)了MYB家族成員，如煙草（Nicotiana tabacum）［11］、玉米（Zea mays）［12］、三七（Panax notoginseng）［7］和蘋果（Malus pumila）樹(shù)［13］。且研究證實(shí)，MYB蛋白在生理代謝、細(xì)胞分化、激素合成及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生理功能中發(fā)揮著重要作用［14］。此外，MYB蛋白在調(diào)節(jié)植物的非生物脅迫反應(yīng)中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［15］。多項(xiàng)研究表明，靶向MYB基因的過(guò)表達(dá)可增強(qiáng)植物的非生物脅迫耐受性，包括擬南芥中的AtMYB20［16］、白樺樹(shù)中的BpIMYB46［17］及水稻中的OsMYB6［18］。盡管已經(jīng)在非生物脅迫條件下的模式和非模式植物中鑒定出許多MYB基因并對(duì)其進(jìn)行功能分析，但關(guān)于建蘭的MYB基因家族成員信息及其功能尚不清楚。基于此，本研究采用全基因組分析建蘭的MYB系統(tǒng)發(fā)育系統(tǒng)、基序組成和重復(fù)序列，并采用qRT-PCR分析目標(biāo)建蘭MYB基因?qū)Σ煌}脅迫類型的表達(dá)水平。研究結(jié)果有助于對(duì)蘭花耐鹽機(jī)制及MYB基因在蘭科中的功能提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 植物材料與培養(yǎng)方法

試驗(yàn)于2020年6—10月在貴州民族大學(xué)園藝組培室中進(jìn)行。建蘭品種為逸紅雙嬌，為2年生組培苗。供試鹽脅迫分別為氯化鈉（NaCl）、硫酸鈉（Na2SO4）、碳酸氫鈉（NaHCO3）、碳酸鈉（Na2CO3），均購(gòu)自默克化學(xué)試劑有限公司。

將2年生的建蘭植株采用MS培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)，繼代培養(yǎng)5周后，按照上述鹽脅迫類型進(jìn)行相應(yīng)處理（150 mmol/L），對(duì)照（CK）為加入無(wú)菌水，之后轉(zhuǎn)移至4 ℃環(huán)境，于鹽脅迫處理后24 h取樣，采用液氮速凍用于植株RNA提取。

1.2 建蘭MYB基因家族的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

1.2.1 建蘭MYB基因的鑒定 從Pfam下載建蘭（C.ensifolium）的MYB DAN-binding結(jié)構(gòu)域信息（PF002499，http：//pfam.sanger.ac.uk/），將其結(jié)構(gòu)域信息保存為隱藏馬爾可夫格式（HMM），并使用hmmer 3.0進(jìn)行檢索。從擬南芥信息資源庫(kù)（https：//www.Arabidopsis.org/）下載擬南芥MYB蛋白序列對(duì)建蘭的MYB基因組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast對(duì)比，參數(shù)設(shè)置值<10-20構(gòu)建fasta文件（CeMYB.fasta）。隨后采用NCBI的conserved Domains Tool工具對(duì)CeMYB.fasta進(jìn)行篩選，以去除CeMYB結(jié)構(gòu)域缺失或不正確的序列；按照Christian等所述的分類方法［19］對(duì)MYB進(jìn)行分類，以得到CeMYB基因家族信息。

1.2.2 建蘭MYB基因的序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析 對(duì)獲得的CeMYB基因家族信息庫(kù)分別進(jìn)行分類分析，采用ExPASy系統(tǒng)（http：//web.expasy.org/compute_pi/）和WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）用于預(yù)測(cè)CeMYB蛋白的分子量、等電點(diǎn)及亞細(xì)胞位置等［20］。采用Clustal W生成多序列比對(duì)，通過(guò)在線工具WebLogo（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）確定MYB蛋白的DNA-binding結(jié)構(gòu)域特征。

通過(guò)MUSCLE軟件對(duì)建蘭和擬南芥的MYB蛋白的全長(zhǎng)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行對(duì)比，將擬南芥的MYB和建蘭MYB的比對(duì)蛋白序列提交到IQ-TREE v1.6.12系統(tǒng)采用鄰接法構(gòu)建MYBs的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 建蘭CeMYB基因結(jié)構(gòu)和保守motif分析 基于基因結(jié)構(gòu)顯示服務(wù)器（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）網(wǎng)站分析該家族成員的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，采用MEME（http：//memesuite.org/tools/meme）設(shè)定基序（motif）數(shù)為2［21］，而其他參數(shù)保持默認(rèn)，利用PSORTP rediction（https：//prosite.expasy.org/）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果采用TBtools軟件進(jìn)行可視化［22］。

1.2.4 建蘭CeMYB基因啟動(dòng)子序列分析、染色體定位和同線性分析 通過(guò)PlantCARE預(yù)測(cè)順式作用元件（http：//bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）基于CeMYB的啟動(dòng)子序列（起始密碼子上游1 500 kb序列）。通過(guò)TBtools根據(jù)建蘭基因組的注釋數(shù)據(jù)獲得CeMYBs在建蘭基因組中的染色體定位。使用TBtools的One Step MCScanx程序顯示每對(duì)建蘭染色體之間的同線關(guān)系［23］，并采用TBtools進(jìn)行可視化分析。

1.3 CeMYB基因響應(yīng)不同鹽脅迫類型的表達(dá)分析

1.3.1 建蘭RNA提取 將建蘭植株根系、假鱗莖、葉片及花序樣品（250 mg）加入液氮快速研磨，按照Plant RNA Kit提取試劑盒（omega）相關(guān)說(shuō)明提取建蘭總RNA，采用Nano Drop 2000紫外分光光度計(jì)（Nano Drop 2000，USA）檢測(cè)RNA濃度，采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)檢驗(yàn)RNA質(zhì)量。

1.3.2 建蘭RT-qPCR分析 將質(zhì)檢合格的RNA采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Ⅱ（Evo M-MLV）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA采用無(wú)菌水稀釋100倍，作為后續(xù)RT-qPCR的模板。建蘭相關(guān)引物采用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（表1），以GAPDH作為內(nèi)參基因。RT-qPCR反應(yīng)體系與反應(yīng)程序參照曹映輝等的方法［24］，使用Bio-Rad（Bio-Rad Laboratories Inc.，USA）的C1000 Touch PCR熱循環(huán)儀和CFX Connect實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)，每個(gè)處理進(jìn)行3個(gè)復(fù)孔，采用2-ΔΔCT [KG*5]法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007對(duì)CeMYB的qRT-PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用DPS 14.0進(jìn)行方差分析及Duncans檢驗(yàn)，相關(guān)圖形采用R5、Origin 2022繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 建蘭MYB轉(zhuǎn)錄因子的篩選

由圖1可知，將建蘭轉(zhuǎn)錄組相關(guān)蛋白序列注釋至PlantTFDB數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)BLAST對(duì)比最終鑒定出10種共678個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。其中，MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的數(shù)量最多，達(dá)143個(gè)，其次為bZIP、bHLH、C3H型轉(zhuǎn)錄因子，分別為99、86、69個(gè)。隨后以擬南芥的MYB蛋白全序列為對(duì)比庫(kù)，通過(guò)BLAST對(duì)比初步鑒定，然后通過(guò)Pfam篩選出來(lái)，在建蘭基因組中共獲得140個(gè)MYB序列，使用hmmer 3.0檢索，共獲得136條完整的MYB序列，其中包括27個(gè)1R-MYB、102個(gè)R2R3-MYB、5個(gè)3R-MYB和2個(gè)4R-MYB，根據(jù)其在染色體上的位置命名為CeMYB1～CeMYB136。

2.2 建蘭MYB基因家族的系統(tǒng)發(fā)育和分類

由圖2可知，對(duì)136個(gè)建蘭MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列信息和131個(gè)擬南芥（A.thaliana）MYB進(jìn)行多序列對(duì)比，根據(jù)對(duì)比結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果表明，建蘭和擬南芥的MYB成員可形成25個(gè)亞家族，分別命名為S1～S25。這些亞家族還包含一些最初不屬于S25亞家族的R2R3-MYB成員，并且大多數(shù)亞群包含來(lái)自建蘭和擬南芥的R2R3-MYB成員，表明一些R2R3-MYB同源成員可能在漫長(zhǎng)的進(jìn)化歷程中發(fā)生了丟失，就建蘭MYB家族成員而言，參照擬南芥MYB的基本表征可將建蘭MYBs分為20個(gè)亞家族，其中，S21亞家族擁有最多的MYB成員（16個(gè)），其次是S14亞家族（10個(gè)），而S7、S9、S16和S19的CeMYB數(shù)量最少，各含2個(gè)。

2.3 建蘭MYB蛋白保守基序分析

2.3.1 建蘭MYB蛋白保守基序分布分析 為研究CeMYB蛋白序列的功能多樣化形式，通過(guò)MEME系統(tǒng)鑒定了CeMYB轉(zhuǎn)錄因子的15個(gè)保守基序（基序1～15）。由圖3-A可知，大多數(shù)基序集中、規(guī)則分布在CeMYBs的N端，少數(shù)基序不規(guī)則分布在C端；屬于同一亞科的CeMYB整體具有較為相似的保守基序，而不同亞科的CeMYB之間基序存在較大差異。大多數(shù)CeMYB具有基序1、2、3、5，幾乎所有CeMYB都包含2個(gè)以上的保守基序，而CeMYB131、CeMYB38和CeMYB40僅含有1個(gè)基序；CeMYB99、CeMYB83和CeMYB129包含基序1和基序5。除了CeMYB86、CeMYB39含有基序10和基序12外，僅S1亞家族的成員有基序10、基序12。此外，基序13僅存在于S21亞家族成員的C端，推測(cè)保守的基序可能與該亞科的特定功能有關(guān)。由圖 3-C 可知，CeMYB82、CeMYB15、CeMYB13、CeMYB14、CeMYB40、CeMYB39、CeMYB8、CeMYB53、CeMYB76、CeMYB75、CeMYB62、CeMYB3、CeMYB59、CeMYB115和CeMYB25無(wú)內(nèi)含子，而其他CeMYB有1～13個(gè)內(nèi)含子。共有66個(gè)CeMYB含有2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，其占CeMYB總數(shù)的49.3%。這些結(jié)果表明，雖然一部分CeMYB的基因結(jié)構(gòu)高度保守，但不同亞科的CeMYBs仍表現(xiàn)出較為復(fù)雜的序列多樣性。

2.3.2 建蘭MYB蛋白保守結(jié)構(gòu)域基序分析 將136個(gè)CeMYB序列信息上傳到WebLogo以檢查該家族成員是否含有共同的保守序列。由圖4可知，CeMYBs的R2和R3結(jié)構(gòu)域相對(duì)保守，在每18個(gè)氨基酸中鑒定出約1個(gè)色氨酸殘基。R2結(jié)構(gòu)域包括3個(gè)色氨酸殘基（W），而R3結(jié)構(gòu)域中的第1個(gè)色氨酸殘基被苯丙氨酸殘基（F）替換；因此，僅有1個(gè)色氨酸殘基存在于R3域中。

2.4 建蘭MYB的染色體定位和共線性分析

2.4.1 建蘭MYB轉(zhuǎn)錄因子的染色體定位 由染色體作圖結(jié)果（圖5）可知，在136個(gè)CeMYB中有134個(gè)CeMYB不均勻分布在建蘭的18號(hào)染色體上，2個(gè)CeMYBs定位于未具體分類的支架上。3號(hào)染色體具有最多的CeMYB（18個(gè)），7號(hào)染色體有11個(gè)CeMYB，1、2、4號(hào)染色體分別有10個(gè)CeMYB，其他染色體具有1～9個(gè)CeMYB。 此外 蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位結(jié)果表明，大多數(shù)CeMYB定位于細(xì)胞核中。

2.4.2 建蘭MYB轉(zhuǎn)錄因子分布的共線性分析 由圖6可知，串聯(lián)重復(fù)和片段重復(fù)都有利于植物基因家族的擴(kuò)增，共線性分析表明，建蘭MYB基因組包含29對(duì)片段復(fù)制的基因。在12號(hào)染色體上具有最多的片段重復(fù)基因，在11、13、14、18、20號(hào)染色體上分別僅發(fā)現(xiàn)了1個(gè)重復(fù)基因。此外，還鑒定出23對(duì)串聯(lián)重復(fù)的基因?qū)Γ渲校蟛糠殖霈F(xiàn)在3號(hào)染色體上。在串聯(lián)重復(fù)的基因中，CeMYB13和CeMYB15、CeMYB75和CeMYB76、CeMYB96和CeMYB97、CeMYB113和CeMYB114、CeMYB105和CeMYB106、CeMYB87和CeMYB88均兩兩位于染色體的相同位置，且均具有較為相似的保守基序和基因結(jié)構(gòu)。

2.5 建蘭MYB在不同組織中的表達(dá)模式分析

由圖7可知，從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得不同組織中108個(gè)CeMYB的表達(dá)水平（有28個(gè)CeMYB在建蘭葉片中不表達(dá)，因此未展示）并繪制Heatmap圖，將這些基因分為7組（A～G）。在108個(gè)CeMYB中，A組有18個(gè)基因在花序（flower）和葉片（leaf）中低表達(dá)，在根系（root）和假鱗莖（stem）中高表達(dá)。此外，由圖8-A可知，A組基因的表達(dá)模式與建蘭植株Na+濃度趨于一致 表明A組基因可能參與了植株的鹽脅迫調(diào)控。B組共14個(gè)基因僅8個(gè)基因在根系中表達(dá)，而在其他組織中不表達(dá)或表達(dá)水平水平較低。C組共9個(gè)基因在花序和根系中的表達(dá)水平較高。D組的22個(gè)基因中，CeMYB78、CeMYB84、CeMYB132在葉片和花序中高表達(dá)，CeMYB130、CeMYB107、CeMYB70、CeMYB119基因在根系和葉片中高表達(dá)。E組13個(gè)基因僅在花序中高表達(dá)。F組中全部基因（15個(gè)）在假鱗莖均具有較高的表達(dá)水平。G組中，除CeMYB94、CeMYB33、CeMYB71基因外，其他基因均在葉片中高表達(dá)，部分基因（CeMYB94、CeMYB33、CeMYB98、CeMYB47）也在假鱗莖中高表達(dá)。值得注意的是，A組CeMYB89和CeMYB61在根系、假鱗莖、葉片及花序中均具有較高的表達(dá)水平，且均屬于S13亞家族，初步表明該兩者基因參與鹽脅迫的調(diào)控，應(yīng)在后續(xù)研究中予以重視。

2.6 qRT-PCR分析靶向CeMYB在不同鹽脅迫類型下的驗(yàn)證

由圖8可知，選擇參與鹽脅迫調(diào)控的S13亞科CeMYB89和CeMYB61，研究其在不同鹽脅迫中的表達(dá)水平，在CeMYB61、CeMYB89中，任一組織器官中CK表達(dá)水平皆較低，鹽（NaCl、Na2SO4、Na2CO3、NaHCO3）脅迫處理均顯著或極顯著大于CK，且鹽脅迫處理間均表現(xiàn)為NaCl假鱗莖>葉片>花序。該表達(dá)模式與建蘭不同組織Na+濃度趨勢(shì)趨于一致，表明兩者基因參與建蘭鹽脅迫的調(diào)控。CeMYB61和CeMYB89在不同組織中的表達(dá)模式與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果基本一致，進(jìn)一步證實(shí)了上述CeMYB基因表達(dá)數(shù)據(jù)的可靠性。

3 討論與結(jié)論

全基因組分析是探索植物中MYB家族生物學(xué)功能的重要方法［25-26］。本研究基于建蘭基因組鑒定出136個(gè)CeMYB轉(zhuǎn)錄因子，其中102個(gè)CeMYB隸屬于R2R3-MYB亞家族，占比75%；其結(jié)果與前人研究基本一致，即在蘭科植物中R2R3-MYB是最大的MYB亞家族，其占比高達(dá)70%以上［27］；而與小麥［28］、煙草［11］等其他物種存在較大差距，數(shù)量差異的原因可能是由基因組大小和基因重復(fù)元件造成的［7］，這也反映了植物R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子在進(jìn)化過(guò)程中的復(fù)雜性和多樣性。

通過(guò)結(jié)合來(lái)自擬南芥的MYB蛋白的系統(tǒng)發(fā)育分析，根據(jù)MYB的保守性和相同功能將相關(guān)基因被歸入同一亞組，CeMYB可劃分為20個(gè)亞科。CeMYB61和CeMYB89歸屬于S13亞科中與AtMYB86、AtMYB50和AtMYB61聚為一類，AtMYB86、AtMYB50在以往的研究中已被證實(shí)參與擬南芥鹽脅迫調(diào)控［16］，初步顯示表明，CeMYB61、CeMYB89可能參與建蘭對(duì)鹽脅迫的調(diào)控。此外，部分建蘭CeMYB成員與擬南芥AtMYB的生物學(xué)特征不同，這表明這些基因可能是擬南芥分化后形成的，其可能具有獨(dú)特的生物學(xué)功能，或者這些基因可能在進(jìn)化過(guò)程中從擬南芥基因組中丟失［29］。基因復(fù)制在植物進(jìn)化中發(fā)揮著重要作用，是基因家族擴(kuò)展的主要機(jī)制。前人研究表明，在擬南芥中發(fā)生了3起全基因組復(fù)制（WGD）事件［30］，而在蘭科植物中則發(fā)生了2次［2］。本研究中，建蘭基因組中有23對(duì)串聯(lián)重復(fù)的CeMYB和29對(duì)分段重復(fù)的CeMYB，基因串聯(lián)重復(fù)事件在染色體上均勻出現(xiàn)，這些結(jié)果表明基因重復(fù)是介導(dǎo)MYB基因家族進(jìn)化的重要事件。

建蘭MYB蛋白保守結(jié)構(gòu)域基序分析表明，CeMYB的結(jié)構(gòu)域包含有代表性的色氨酸殘基，其中R2具有3個(gè)高度保守的色氨酸殘基，而R3中的第1個(gè)色氨酸殘基被苯丙氨酸取代。這一結(jié)果與在矮牽牛（Petunia hybrida Vilm）中觀察到的結(jié)果一致［31］，每個(gè)R基序中的色氨酸殘基有助于維持螺旋-轉(zhuǎn)螺旋（HTH）結(jié)構(gòu)，使MYB轉(zhuǎn)錄因子能夠與DNA結(jié)合［32］；R3中色氨酸殘基被取代可能有助于識(shí)別新的靶基因，也可能導(dǎo)致DNA與靶基因的結(jié)合活性喪失［29］。此外，建蘭MYB蛋白保守基序分布分析表明，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中密切相關(guān)的CeMYB具有相似的保守基序，大多數(shù)CeMYB包含基序1、2、3、5。且大多數(shù)CeMYB（49.3%）包含2個(gè)內(nèi)含子和3個(gè)外顯子，僅有S1亞家族的成員具有基序13，這意味著S1中的CeMYB可能具有不同于其他亞群的特殊功能。總體而言，同一進(jìn)化分支中的基序、內(nèi)含子和外顯子的數(shù)量較為相似，僅少數(shù)CeMYB發(fā)現(xiàn)了變異。

本研究中，建蘭MYB的轉(zhuǎn)錄組分析表明，不同組織中僅S13亞科中CeMYB61、CeMYB89的表達(dá)模式與建蘭組織中的Na+濃度分布趨勢(shì)一致，再次表明該兩者基因可能參與建蘭耐受鹽脅迫的調(diào)控。qRT-PCR結(jié)果表明，CeMYB61、CeMYB89在不同組織中表現(xiàn)為根系>假鱗莖>葉片>花序，其表達(dá)水平、模式與組織中的Na+濃度一致，證實(shí)了CeMYB61、CeMYB89是建蘭耐受鹽脅迫的指示基因。此外，就轉(zhuǎn)錄豐度來(lái)看，在任一組織器官中，CeMYB61、CeMYB89均表現(xiàn)為從最大至最小列為NaCl

綜上，本研究從建蘭基因組中共鑒定出136個(gè)CeMYB轉(zhuǎn)錄因子，通過(guò)與擬南芥MYB進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育得到20個(gè)基因簇，根據(jù)TBtools進(jìn)行染色體定位顯示，136個(gè)CeMYB均勻分布在18條染色體上。保守域分析表明，它們具有典型的氨基酸序列重復(fù)，基序預(yù)測(cè)顯示，多個(gè)保守元件主要位于CeMYB的N端，表明它們的功能相對(duì)保守，大多數(shù)CeMYB位于細(xì)胞核中；基于CeMYB的轉(zhuǎn)錄組表達(dá)分析表明，S13亞科的CeMYB61和CeMYB89可能是調(diào)控鹽脅迫的關(guān)鍵基因，qRT-PCR驗(yàn)證顯示CeMYB61、CeMYB89表達(dá)水平、模式與各組織中的Na+濃度分布一致，證實(shí)了CeMYB61、CeMYB89是建蘭耐受鹽脅迫的指示基因。

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收稿日期：2023-05-13

基金項(xiàng)目：貴州省特色林業(yè)產(chǎn)業(yè)項(xiàng)目（編號(hào)：特林研2020-04）；貴州省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項(xiàng)目（編號(hào)：S202010672021）。

作者簡(jiǎn)介：鄧文楷（1996—），男，四川自貢人，碩士研究生，主要從事園藝環(huán)境工程研究。E-mail：dl18222235394@163.com。

通信作者：彭 艷，博士，副教授，主要從事生物環(huán)境地球化學(xué)研究。E-mail：yan.jane.peng@ gmail.com。