隔離降水對杉木幼樹細根生理特征的影響

陳心怡, 吳晨, 黃錦學, 熊德成 , 楊智杰

(1. 福建師范大學，a. 福建省植物生理生態重點實驗室；b. 地理科學學院，福州 350007；2. 福建三明森林生態系統國家野外科學觀測研究站，福建 三明 365002)

據IPCC 報告，全球降水格局可能會在未來20年內發生顯著改變，部分陸地干旱發生的頻率、強度將有所增加[1]。干旱環境會干擾植物體內許多生理生化過程，如導致植物細胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)代謝失衡并積累大量丙二醛(malondialdehyde, MDA)，從而影響細胞膜的穩定、離子平衡和蛋白質的變性等，極端干旱條件下植物還可能減產甚至死亡[2–3]。一些抗旱相關的生理指標如抗氧化酶和非酶促物質(滲透調節物質、內源激素等)都對維持ROS 代謝平衡起著重要作用。其可形成抗氧化系統以清除ROS 自由基，積累溶質增強滲透調節,以及通過激素抑制生長從而減少能量消耗等[4–5]。從植物器官來看，干旱將使葉片數量減少并且大幅降低氣孔導度和光合速率，地下根系的生理特征也將受到影響[6]。而細根(直徑≤2 mm)作為根系中活躍度和敏感度最高的部分，是植物吸收水分、養分和適應干旱環境的重要器官，其感受土壤水分含量的變化后可向上傳遞化學信號進行適應調節[5,7]。因此，有必要對林木在降水減少下細根生理特征指標的變化進行試驗與研究。

近年來土壤水分狀況與植物細根關系的研究已引起重視，但關于細根對降水減少的生理響應機制還有待深入研究。隔離降水試驗中細根酶促系統的響應仍存在爭議。有研究表明干旱時細根過氧化氫酶和過氧化物酶活性顯著增強，一定程度上減輕了細根細胞膜的干旱損傷[5,8]；而吳永波等[9]認為抗氧化酶對減輕干旱帶來的細根膜脂過氧化的傷害作用有限。有研究表明，隨著干旱強度增加，細根可溶性糖和淀粉總量下降，ROS 含量顯著增加，其中過氧化氫水平上升尤為顯著，細根功能受損，水分利用效率下降[10–11]；并且，細根能利用抗壞血酸-谷胱甘肽循環維持細胞氧化還原以應對干旱[12–13];鐘波元等[14]認為隔離降水使細根養分失衡但淀粉含量增加，總體影響并不顯著等。關于干旱對細根生理特征的影響研究主要集中在ROS 代謝和抗氧化酶活性、碳匯/源[15–16]、非結構性碳水化合物[17]、滲透調節物質積累[18]等方面，缺乏細根對干旱響應重要生理指標的研究，在抗旱指標的選取上也不夠全面。故綜合考慮細根ROS 代謝、植物酶活性和非酶促物質含量等指標與植物抗旱性的關系尤為重要。

有研究表明，1980 年以來亞熱帶地區土壤干旱程度加劇[19–20]，目前國內外對于森林土壤干旱響應的研究主要集中在北半球干旱、半干旱區等，試驗對象也多為耐旱作物[5]，對濕潤亞熱帶地區森林干旱響應的研究還較為缺乏。杉木(Cunninghamia lanceolata)作為濕潤亞熱帶地區的優勢造林樹種,占世界人工林面積的6.5%、我國人工林面積的19%,對我國林業生產意義重大[21]。基于此，本文提出以下2 個科學問題：(1) 50%的降水隔離是否顯著改變了亞熱帶杉木幼樹細根的生理特性？(2) 杉木幼樹細根如何在生理方面(酶促與非酶促抗氧化系統)進行干旱響應，各生理指標間有何關聯?本研究選取杉木幼樹為研究對象，利用隔離降水試驗(0，–50%)對細根的ROS 代謝與抗氧化酶活性、滲透調節物質和內源激素等生理特征指標進行研究，為我國亞熱帶人工林的生產力提升以及全球變化背景下地下生態系統的適應機制等研究提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 研究地概況

試驗地位于福建三明森林生態系統國家野外科學觀測研究站陳大觀測點(26°19′ N，117°36′ E)。該區屬中亞熱帶季風氣候，年平均氣溫19.1 ℃，年平均降水量1 688 mm，降水集中在3 月—8 月。區域地形多為山地丘陵，平均海拔300 m。土壤以黑云母花崗巖發育的紅壤為主。

1.2 試驗設計

試驗設置2 個處理：隔離降水50% (PR)和對照(CK)，每處理5 個重復，共計10 個小區，小區隨機排列。每個小區面積為2 m×2 m，小區周圍用4 塊PVC 板(70 cm×200 cm)隔開以防止區間干擾,PVC 板埋入地下70 cm (圖1)。試驗所用土壤取自觀測站附近的杉木人工林，為了消除土壤的異質性(同一土壤類型上不同空間位置取樣所測定的土壤養分和水分等因子的差異性)[22]，按0～10、10～20、20～70 cm 分層取回并去除雜物(根系、沙石等)，充分混拌均勻后分層填至各小區內，調整土壤容重使其接近原杉木林地。于2013 年11 月在每個小區內均勻種植4 棵1 a 生短側枝杉木幼苗并用號碼牌標記，各杉木幼苗的苗高與地徑均相近，苗高(25.7±2.5) cm，地徑(3.4±0.4) mm。同時在小區1.5 m 高處每隔5 cm 放置一根透明瓦浪板(0.05 m×5 m)，將其固定于支架上均勻鋪滿隔離降水試驗樣區(圖1), 以達到50%的降水隔離，瓦浪板裝置高度隨試驗地杉木幼苗的生長進行定期升高。于各試驗小區地表下10 cm 處布設土壤溫濕度傳感器，用以監測土壤溫度和水分變化，空氣溫度和降雨量采用氣象站進行監測。從2018 年4 月的監測數據來看，PR 與CK 處理的土壤溫度無顯著差異，但土壤濕度顯著下降(P<0.05)，初步判斷試驗達到預期降水隔離效果。

圖1 試驗樣地及隔離降水裝置示意圖。A: 試驗樣地全景；B: 隔離降水試驗樣地；C: 隔離降水裝置示意圖。Fig. 1 Schematic diagram of sample plot and precipitation exclusion device. A: Perspective of sample plot; B: Precipitation exclusion sample plot; C: Schematic diagram of precipitation exclusion device.

1.3 杉木細根取樣及生長調查

2018 年4 月(隔離降水4 a 后)，采用土芯法, 于每個試驗小區隨機(中心和邊緣等地均有取樣以保證其隨機性)取6 個土鉆，土鉆內徑3.5 cm，取樣深度為10 cm。將每個樣地各土鉆的細根挑出并混合均勻，隨后將根系裝入分根盤，對杉木細根進一步分選。采用徑級法將根系樣品分為0～1 和1～2 mm細根(本研究選取0～1 mm 根系為研究對象)，并根據表皮的顏色、脫落及褶皺情況挑出活細根，挑選好的細根用干冰進行保存。取樣的同時對樹高和胸徑生長進行同步測定。

1.4 方法

ROS 與MDA 含量測定超氧陰離子自由基(superoxide radical,)采用羥氨氧化法測定[23]，過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)含量采用Prochazkova 等[24]的方法測定，MDA 含量采用硫代巴比妥酸法(TBA)測定[25]。

滲透調節物質濃度測定可溶性蛋白(soluble protein, SP)濃度采用考馬斯亮藍比色法測定[26]，脯氨酸(proline, Pro)含量采用酸性茚三酮比色法測定[27],谷胱甘肽(glutathione, GSH)含量參考Kampfenkel等[28]的方法測定。

保護酶活性測定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性采用黃嘌呤氧化酶法測定[29]；過氧化氫酶(catalase, CAT)活性采用紫外線吸收法，參照Trevor 等[30]的方法測定；過氧化物酶(peroxidase, POD)活性采用愈創木酚比色法測定[31];谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase, GPX)活性采用Khatuna 等[32]的方法測定；總抗氧化能力(total antioxidant capacity, T-AOC)參照Dinis 等[33]的方法測定。

內源激素含量測定脫落酸(abscisic acid,ABA)、吲哚乙酸(indoleacetic acid, IAA)和細胞分裂素(cytokinin, CTK)均參考Voesenek 等[34]的方法測定。

1.5 數據處理

利用SPSS 25.0 軟件對數據進行處理分析，采用獨立樣本t檢驗對兩種處理間土壤溫濕度、杉木樹高、胸徑生長及細根各指標的差異進行分析，同時采用Pearson 相關性分析對丙二醛、過氧化氫、超氧陰離子自由基與滲透調節物質、保護酶活性及內源激素間的關系進行分析。顯著性水平設定為P=0.05。利用Origin 10.5 軟件完成作圖。

2 結果和分析

2.1 杉木幼樹生長特征變化

從表1 可見，2018 年4 月監測的土壤溫度，PR處理與CK 間無顯著差異，但土壤濕度顯著下降(P<0.05)；PR 處理的樹高、胸徑較CK 分別顯著提高21.6%和18.5% (P<0.05)。

表1 隔離降水對土壤溫濕度及杉木生長的影響Table 1 Effect of precipitation exclusion on soil temperature, humidity and growth of Cunninghamia lanceolata

2.2 隔離降水對細根活性氧和丙二醛含量的影響

由圖2 可知，與CK 相比，隔離50%降水使杉木幼樹細根的H2O2含量顯著增加(P<0.05)，約為CK的1.5 倍；O2和MDA 含量無顯著變化(P>0.05)。

圖2 隔離降水對杉木幼樹細根活性氧和丙二醛含量的影響。H2O2: 過氧化氫; O2: 超氧陰離子自由基; MDA: 丙二醛。下同Fig. 2 Effects of precipitation exclusion on reactive oxygen species and malondialdehyde contents in fine roots of Cunninghamia lanceolata saplings. H2O2:Hydrogen peroxide; O2: Superoxide radical; MDA: Malondialdehyde. The same below

2.3 隔離降水對細根滲透調節物質和保護酶活性的影響

與CK 相比，PR 處理的細根SP 含量變化不顯著(P>0.05)，Pro 和GSH 含量顯著增加(P<0.05)，約為CK 的1.4 倍(圖3)。從圖4 可見，隔離降水對細根不同保護酶活性的影響不同，PR 處理后細根SOD活性顯著降低了21.5%，POD 活性顯著增加16.7%(P<0.05)，而CAT、GPX 活性和T-AOC 無顯著變化(P>0.05)。

圖3 隔離降水對杉木幼樹細根滲透調節物質的影響。SP: 可溶性蛋白; Pro: 脯氨酸; GSH: 谷胱甘肽。下同Fig. 3 Effect of precipitation exclusion on osmoregulation substances in fine roots of Cunninghamia lanceolata saplings. SP: Soluble protein; Pro: Proline; GSH:Glutathione. The same below

圖4 隔離降水對杉木幼樹細根保護酶活性的影響。SOD: 超氧化物歧化酶; CAT: 過氧化氫酶; POD: 過氧化物酶; GPX: 谷胱甘肽過氧化物酶; T-AOC:總抗氧化能力。下同Fig. 4 Effect of precipitation exclusion on antioxidant enzyme activities in fine roots of Cunninghamia lanceolata saplings. SOD: Superoxide dismutase; CAT:Catalase; POD: Peroxidase; GPX: Glutathione peroxidase; T-AOC: Total antioxidant capacity. The same below

2.4 隔離降水對細根內源激素的影響

由圖5 可知，與CK 相比，PR 處理的細根ABA含量無顯著變化(P>0.05)，而IAA 和CTK 含量分別顯著下降16.5%和15.4% (P<0.05)。

2.5 相關性分析

對11 個與抗旱相關的生理指標和ROS、MDA含量進行相關性分析(表2)，結果表明，杉木細根的T-AOC 與MDA、O2含量分別呈顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)正相關關系；GSH 含量與MDA含量呈顯著正相關關系(P<0.05)，與H2O2含量呈極顯著正相關關系(P<0.01)；其余指標間的相關性不顯著。

表2 丙二醛、過氧化氫、超氧陰離子自由基與滲透調節物質、保護酶活性及內源激素間的相關性分析Table 2 Correlation analysis between malondialdehyde, hydrogen peroxide, superoxide radical and osmotic adjustment substances, antioxidant enzyme activities, endogenous hormones

3 結論和討論

3.1 隔離降水對細根ROS 和MDA 的影響

ROS 是性質極為活潑且氧化能力強的含氧物的總稱，包括O2、H2O2等，對細胞膜脂質氧化作用強，且氧化過程將產生MDA，因此可以通過MDA的含量來判斷植物細胞膜脂過氧化程度[9]。在正常降水背景下，植物體能維持ROS 產生與清除的動態平衡[9]。隔離降水試驗結果表明，土壤濕度顯著下降，并且杉木幼樹細根的O2和MDA 含量變化不顯著，而H2O2含量顯著增加。這表明干旱導致了杉木細根膜脂過氧化概率的增加但受損程度較低。其中H2O2的顯著增加可能是由于4 a 降水隔離后，ROS 的增加一定程度上誘導了活性氧清除酶系統的活性，如H2O2的清除酶POD 和CAT 活性的提高，但長期的水分缺失可能已導致H2O2積累超過一定閾值，酶促系統的防御不足以控制其增長，保護酶活性與活性氧物質含量沒有顯著相關性可作為佐證。此外，雖然O2的主要清除酶SOD 活性顯著下降，但O2濃度無顯著變化。可能是細根抗氧化系統中GSH 含量的顯著增加，使得自由基分解速率加快，這也是其分解物之一H2O2含量顯著增加的可能原因。而土壤濕度較對照顯著下降12.9%，MDA含量卻并未出現明顯變化，表明杉木細根對于干旱造成的膜脂氧化適應性較強，能進行一定程度的自我修護，這與種培芳等[6]對紅砂(Reaumuriasoongorica)的研究結果相似。

3.2 細根抗氧化系統對隔離降水的響應

滲透調節是植物抗氧化系統的重要組成部分,細胞通過滲透調節維持正常膨壓，保持各種生理過程的正常運行，植物根系的滲透調節能力與抗旱性正相關[6]。SP 能提高細胞的保水性，Pro 能保護蛋白質在水分脅迫下不變性，在調節細胞氧化還原方面起重要作用，正常情況下其含量不高，而GSH是一種重要的非酶抗氧化劑[35–37]。本研究結果表明，與對照相比，杉木細根的Pro 和GSH 含量顯著增加，這可能是杉木細根對生存環境水分缺失的一種信號, 也表明杉木的抗旱能力較強，在土壤水分顯著減少的情況下能通過積累滲透物質進行有效調節。H2O2可以誘導GSH 含量的增加[37]，本試驗中GSH 與H2O2含量呈極顯著正相關，證實了這一觀點。而在水分缺失環境下，可將GSH 分解為氧化型谷胱甘肽(GSSG)的GPX 活性并未有顯著變化,這也是GSH 含量增加的可能原因之一。Pro 濃度顯著提高的可能原因在于長期干旱造成的碳水化合物增加，從而促進Pro 的合成；此外還有研究表明PR 處理下植物氮代謝將發生變化，這也會造成Pro的大量積累[15]，使杉木的滲透調節能力增強。本研究還表明，雖然長期干旱會影響蛋白質的合成，也使得SP 開始分解，但試驗中SP 含量卻無顯著變化，可能有Pro、GSH 含量顯著增加的原因存在，使其穩定性得到保護，有利于維持杉木對于水分、養分的吸收。

SOD、CAT、POD、GPX 等是植物抗氧化代謝的主要酶類，可清除植物體內的ROS，整個酶促防御系統的抗氧化能力取決于這幾種酶的協同作用效果[12]。本研究表明，隔離降水下杉木細根的POD、CAT 活性較對照增強。其中，POD 活性顯著增強，表明其對水分變化較敏感，在長期隔離降水情況下能持續作出響應。SOD、GPX 活性較對照降低，并且SOD 活性表現為顯著降低，原因可能是大量增加的H2O2對SOD 活性的鈍化作用[9]。總體來看, 隔離降水條件下杉木細根的總抗氧化能力較對照無顯著變化，可能是因為土壤溫度并未出現顯著變化的原因，使得抗氧化酶系統部分酶的抗氧化過程變緩。SOD 活性與O2含量，CAT、POD 活性與H2O2含量間均未表現出明顯的相關性，并且H2O2與CAT的Pearson 相關系數的絕對值最小，表明杉木細根ROS 的酶促抗氧化系統對水分缺失的適應調控較弱。可見若只改變杉木抗氧化酶活性，對減輕水分減少帶來ROS 失衡從而造成膜脂過氧化傷害的作用有限。

內源激素在植物根源信號傳導中起重要作用,植物體可通過改變激素的含量、比例來調節氣孔開閉，調控植物生長，從而影響植物的抗逆性。ABA是植物感知干旱刺激的根源信號，能促進根部對水和離子的吸收，而CTK 可以促進細胞分裂，延緩細胞衰老，IAA 對植物生長也有促進作用，并且ABA與CTK、IAA 間存在拮抗關系[38]。干旱環境對植物的ABA 合成起促進作用，而對IAA、CTK 合成起抑制作用[39]。本研究中，隔離降水后杉木細根的IAA、CTK 分別顯著降低了16.5%和15.4%，可能是因為H2O2顯著增加，使得杉木細根膜結構的完整性受到威脅，但卻有利于ABA 的積累。杉木細根的ABA 含量較對照并未出現顯著提高，與前人研究結果不一致，可能是長期適度降水隔離下杉木調節能力強，使得作為根源信號的ABA 響應靈敏，在完成誘導和啟動杉木細根的抵抗防御后逐漸下降至正常水平。呂東[40]研究表明ABA 通過誘導H2O2等物質的產生促使氣孔關閉，二者間大概率存在協同效應。杉木細根生理指標的相關性分析表明,ABA 與自由基含量呈負相關關系，Pearson 相關系數為0.712，因此ABA 在杉木的抗旱防御過程中可能有一定作用。在一定濃度范圍內，CTK、IAA 濃度越低，植物氣孔導度也越低[39–40]。故雖然杉木在干旱環境前期主要依靠ABA 濃度的增加傳遞關閉氣孔的根源信號，但是長期降水隔離后可能選擇通過降低CTK、IAA 濃度來抑制氣孔開放，以有效應對土壤水分的顯著降低。

3.3 細根抗旱生理指標與杉木生長變化特征探究

已有研究表明T-AOC 與ROS 代謝平衡有重要聯系[12,37]。本研究中滲透調節物質與ROS 指標的相關程度為GSH>Pro>SP，其中GSH 與H2O2和MDA均呈極顯著正相關，因此也可以將GSH 作為衡量杉木細根耐旱性的指標之一。此外，逆境時植物體內激素的平衡和比值變化也對其生長、生理特性產生影響。本研究中杉木細根IAA/ABA 較對照顯著降低，而由土壤溫濕度及杉木生長特征數據可知,隔離降水試驗地土壤濕度較對照顯著降低，杉木幼樹的樹高和胸徑顯著增加，這與一般隔離降水試驗中CTK、IAA、IAA/ABA 隨土壤濕度降低顯著下降從而使植物生長受抑制的結果相反[38–39,41–42]。從試驗地杉木生長情況來探究其可能的原因，一是隔離降水前期ABA 以及滲透物質增加使其建立了適應機制，并且這種機制可能持續作用于細根生長,使杉木根系更為發達[43]，試驗地杉木樹高胸徑與對照相比顯著增加；二是CTK、IAA 與杉木的生長未表現出明顯相關性，長期隔離降水處理導致的低土壤濕度環境也可能使得杉木細根內部建立了新的激素平衡，促使杉木正常生長發育，杉木細根在激素調控方面呈現主動的干旱適應性。

綜上，隔離降水后杉木細根H2O2含量顯著增加, 一方面提高了ABA、GSH 含量；另一方面也影響CTK、IAA 合成，但CTK、IAA 對杉木生長調控貢獻小。與對照處理相比，隔離降水后土壤濕度顯著下降，并且杉木細根O2、MDA 含量變化不顯著。相對干旱環境下其GSH、Pro 顯著增加從而提高滲透調節，清除自由基并降低膜脂損傷，而早期ABA 濃度的增加也促進了杉木對土壤水分缺失的適應。綜合作用下，杉木樹高、胸徑顯著增長。抗氧化酶對于杉木細根的干旱適應調控影響弱，主要依靠非酶促抗氧化系統的保護作用，其中有關隔離降水條件下杉木細根各內源激素間協調平衡的復雜機制還需進一步研究。