哈維氏弧菌可視化LAMP快速檢測方法的建立及應用

李 濤，周永燦，曹貞潔，孫 云

（海南大學海洋生物與水產學院/海南省熱帶水生生物技術重點實驗室/南海海洋資源利用國家重點實驗室，海南 海口 570228）

石斑魚（Epinephelus）主要在我國東南沿海一帶養殖，是我國南方漁民重要的經濟來源之一[1]。哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）是一種廣泛分布于海洋中的嗜鹽性條件致病菌，可嚴重威脅石斑魚、卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）、矛尾復蝦虎魚（Synechogobius hasta）、方斑東風螺（Babylonia areolata）等多種水產動物的健康[2-5]。由哈維氏弧菌引起的弧菌病被認為是石斑魚養殖過程中主要的疾病之一，流行時間多處于夏季高溫期，當外界條件適宜，哈維氏弧菌大量繁殖，并通過石斑魚的傷口、鰓或消化道侵染機體，導致機體組織器官發生病變，最終導致石斑魚的死亡[6]。隨著水產動物病害問題的日益突出，“早發現早治療”變得尤為重要，因此，加強病原早期的快速診斷和篩查，研發病原的快速檢測手段迫在眉睫。

環介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification,LAMP）技術是目前等溫擴增領域應用最多的方法，其具有高特異性、高靈敏度、設備簡單（簡易恒溫裝置即可）、反應快速（可在1 h內對靶序列實現109倍的擴增）等諸多優勢[7]。此外，LAMP技術已實現擴增產物的可視化，即可通過在擴增產物中加入鈣黃綠素、SYBR Green I、Neutral red、SYTO-9 等染料后直接肉眼觀察顏色變化來判定反應情況，避免通過電泳檢測、濁度儀等方法的費時現象，突破了該技術使用場合的局限性，在病原快速檢測方面具有巨大的發展潛力[8]。目前，LAMP技術已在斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）病毒（CCV）[9]、遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）[10]、鰻弧 菌（Vibrio anguillarum）[11]、柱狀黃桿菌（Flavobacterium columnare）[12]以及華支睪吸蟲（Clonorchis sinensis）[13]等諸多病原的檢測上得到廣泛應用。Toic是革蘭陰性菌廣泛存在的一種保守蛋白，在細菌致病性、耐藥性、生物被膜形成以及維持細菌胞內環境穩定等方面發揮重要的作用[14]。為加強對哈維氏弧菌的早期快速診斷和篩查，本研究以哈維氏弧菌Toic為靶基因，設計LAMP 擴增引物，以鈣黃綠素染料為擴增結果指示劑，建立一種可視化的哈維氏弧菌LAMP快速檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：哈維氏弧菌分離自海南某養殖場患病珍珠龍膽石斑魚（Epinephelus lanceolatus♂×Epinephelus fuscoguttatus♀），經16S RNA 測序鑒定后保存。副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）、溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）、霍亂弧菌（Vibrio cholerae）、創傷弧菌（Vibrio vulnificus）、擬態弧菌（Vibrio mimicus）、阿爾法克弧菌（Vibrio alfacsensis）、坎氏弧菌（Vibrio campbellii）、歐氏弧菌（Vibrio owensii）與金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）均由海南大學海洋生物與水產學院經16S RNA測序鑒定后保存。

試劑：Bst DNA 聚合酶（大片段，8 U/μL）、MgSO4購自New England Biolabs 公司；甜菜堿、鈣黃綠素、MnCl2購自北京索萊寶科技有限公司；Taq DNA 聚合酶購自寶生物工程（大連）有限公司；dNTPs（10 mmol/L）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；細菌基因組DNA快速提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。鈣黃綠素混合液母液：將鈣黃綠素溶于二甲基亞砜（DMSO）配制成5 mmol/L 溶液，再加入20 mmol/L MnCl2溶液進行淬滅。

儀器與設備：恒溫水浴鍋（常州越新儀器制造有限公司，中國）；PCR 擴增儀（Bio-red，美國）；凝膠成像系統（上海天能科技有限公司，中國）；-80 ℃超低溫冰箱（Thermo Fisher Scientific，美國）；高速臺式離心機（Eppendorf，德國）；超微量分光光度計（Biodrop，英國）；恒溫震蕩搖床、電泳儀（北京六一儀器廠，中國）。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 從美國國家生物技術信息中心（NCBI）數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中獲取多株哈維氏弧菌及其他多種病原菌的Toic基因序列，基于局部比對算法搜索工具（BLAST）分析比對，選取哈維氏弧菌Toic（GenBank 登錄號：APP06536.1）高度保守的部分，通過在線程序軟件Primer Explorer version 5.0（http://www.http://primerexplorer.jp）設計Toic-1、Toic-2 和Toic-3 共3套特異性引物組，每套引物組中均包括兩個外引物（F3、B3）和兩個內引物（FIP、BIP），另外再使用引物設計軟件Primer 5.0 設計兩個環引物LF 和LB。引物序列見表1，所有引物均由北京擎科生物科技股份有限公司合成。

表1 LAMP擴增引物及其序列Table 1 Primer sequences used for LAMP

1.2.2 細菌培養和基因組DNA的制備 將哈維氏弧菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、創傷弧菌、擬態弧菌、阿爾法克弧菌、坎氏弧菌、歐氏弧菌、金黃色葡萄球菌劃線接種于Luria-Bertani（LB）固體培養基上，金黃色葡萄球菌在溫度37 ℃下，其余弧菌在溫度30 ℃下培養12～16 h 后，挑取單菌落于LB 液體培養基中，37 ℃或30 ℃下震蕩培養至光密度D600nm≈0.8。使用細菌基因組DNA提取試劑盒提取各菌株的基因組DNA，作為LAMP擴增反應體系中的模板。

1.2.3 LAMP基本擴增體系及最佳引物組篩選 以提取的哈維氏弧菌基因組DNA 為模板，將3 套擴增引物組分別加入以下LAMP基本擴增體系中。基本擴增體系總體積為25 μL，其組分包括：10×ThermoPol Buffer 2.5 μL，MgSO4（100 mmol/L）1.5 μL，dNTPs（10 mmol/L）3.5 μL，內引物FIP、BIP（10 μmol/L）各2 μL，外引物F3、B3（10 μmol/L）各0.5 μL，環引物LF、LB（10 μmol/L）各1.5 μL，Bst DNA聚合酶（8U/μL）1 μL 和基因組DNA 模板（1 ng/μL）1 μL，ddH2O 補齊至25 μL。在恒溫水浴鍋中進行擴增反應，程序為：60 ℃，60 min；80 ℃，5 min。反應產物經20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測，以篩選出最佳引物組。

1.2.4 LAMP 擴增反應體系優化 在使用1.2.3 節篩選出的最佳引物組的基礎上，采用單一變量法對LAMP 擴增反應體系進行優化。固定Mg2+濃度為6 mmol/L，dNTPs 濃度為1.4 mmol/L，外內引物比例為1∶4，環引物濃度為0.6 μmol/L，甜菜堿濃度為0 mmol/L，對鈣黃綠素混合液濃度（20、50、100、150、200 μmol/L）進行優化；固定鈣黃綠素混合液濃度100 μmol/L，dNTPs 濃度為1.4 mmol/L，外內引物比例為1∶4，環引物濃度為0.6 μmol/L，甜菜堿濃度為0 mmol/L，對Mg2+濃度（2、3、4、5、6、7、8 mmol/L）進行優化；固定鈣黃綠素混合液濃度100 μmol/L，Mg2+濃度為6 mmol/L，外內引物比例為1∶4，環引物濃度為0.6 μmol/L，甜菜堿濃度為0 mmol/L，對dNTPs 濃度（0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mmol/L）進行優化；固定鈣黃綠素混合液濃度100 μmol/L，Mg2+濃度為6 mmol/L，dNTPs濃度為1.4 mmol/L，環引物濃度為0.6 μmol/L，甜菜堿濃度為0 mmol/L，對外內引物比例（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8）進行優化；固定鈣黃綠素混合液濃度100 μmol/L，Mg2+濃度為6 mmol/L，dNTPs濃度為1.4 mmol/L，外內引物比例為1∶4，甜菜堿濃度為0 mmol/L，對環引物濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 μmol/L）進行優化；固定鈣黃綠素混合液濃度100 μmol/L，Mg2+濃度為6 mmol/L，dNTPs 濃度為1.4 mmol/L，外內引物比例為1∶4，環引物濃度為0.6 μmol/L，對甜菜堿濃度（0、2、4、6、8、10、12 mmol/L）進行優化。在恒溫水浴鍋中進行擴增反應，反應程序為：60 ℃，60 min；80 ℃，5 min。反應結束后，產物通過鈣黃綠素熒光顯色法和20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進行結果判定：一方面直接通過肉眼觀察反應液顏色變化來判斷是否有靶序列進行擴增（陽性為亮綠色，陰性為橙黃色），另一方面用20 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，最后結合實際應用及后期集成，確定合適的LAMP 擴增反應體系。

1.2.5 LAMP 擴增反應溫度優化 以1.2.4 節中優化的LAMP 擴增反應體系為基礎，設計不同的反應溫度：58、59、60、61、62、63 ℃，進行擴增反應。反應結束后，產物參照1.2.4節通過鈣黃綠素熒光顯色法和20 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳進行結果判定，最后結合實際應用及后期集成，確定適宜的LAMP 擴增反應溫度。

1.2.6 LAMP 擴增反應時間優化 以1.2.4節與1.2.5節中優化的LAMP 擴增反應體系和反應溫度為基礎，設計不同的反應時間：30、35、40、45、50、55、60 min，進行擴增反應。反應結束后，產物參照1.4.4節通過鈣黃綠素熒光顯色法和20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進行結果判定，最后結合實際應用及后期集成，確定最短的LAMP擴增反應時間。

1.2.7 哈維氏弧菌Toic 基因質粒標準品的制備 以哈維氏弧菌基因組DNA 為模板，以1.2.3 節篩選出的最佳引物組中的外引物F3、B3 為引物，進行常規PCR 擴增。PCR 反應體系總體積為25 μL，其組分包括：2×Rapid Taq Master Mix 13 μL，引物F3 和引物B3 各1μL，DNA 模板（1 ng/μL）1μL，ddH2O 補齊至25 μL。反應程序：1）95 ℃預變性5 min；2）95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，共30個循環；3）72 ℃延伸5 min。反應結束后，產物使用15 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。將PCR 擴增的陽性產物進行切膠回收，并將回收后的Toic目標片段連接到pEASY-T1-simple vector 上，構建重組質粒T1-Toic，并轉化至Escherichia coliDH5α 感受態細胞中，經藍白斑篩選后挑取單克隆，經PCR 檢測后送至深圳華大基因科技有限公司測序，測序成功的陽性克隆經擴大培養后用質粒提取試劑盒提取重組質粒作為標準品備用。

1.2.8 LAMP 擴增反應特異性檢測 以1.2.2 節中提取的各菌株基因組DNA為模板，同時設置哈維氏弧菌Toic基因質粒標準品為陽性對照，ddH2O 為陰性對照，按照1.2.4—1.2.6 節中優化的LAMP 擴增反應體系和反應條件進行擴增反應。反應結束后，反應產物參照1.2.4節通過鈣黃綠素熒光顯色法和20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進行結果判定，以確定LAMP 擴增反應體系的特異性。

1.2.9 LAMP 及常規PCR 擴增反應靈敏度檢測 采用細菌基因組DNA 提取試劑盒提取培養12 h 的哈維氏弧菌的基因組DNA，測量濃度后，用ddH2O 稀釋將模板濃度調整為10、100 fg/μL，1、10、100 pg/μL，1、10、100 ng/μL，作為靈敏度檢測的模板。按照1.2.4—1.2.6節中優化的LAMP擴增反應體系和反應條件進行擴增反應。反應產物參照1.2.4節通過鈣黃綠素熒光顯色法和20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進行結果判定，以確定LAMP擴增反應體系的靈敏度。

以上述稀釋后的哈維氏弧菌基因組DNA 作為模板，以外引物F3、B3為引物，進行常規PCR 反應。反應體系和反應程序參照1.2.7 節進行。反應產物利用20 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測，以確定常規PCR擴增反應體系的靈敏度。

1.2.10 LAMP 檢測方法的驗證及在石斑魚中的初步應用 將30 尾健康無病的珍珠龍膽石斑魚暫養于循環水養殖系統中，隨機分為2組（攻毒組和對照組），每組15 尾。震蕩培養哈維氏弧菌12 h，調整菌液濃度至1×105CFU/mL，攻毒組的每尾魚腹腔注射100 μL 哈維氏弧菌懸液。肝臟是哈維氏弧菌侵染魚體的靶器官之一[15-17]，因此，本研究在攻毒24 h后取肝臟進行哈維氏弧菌的檢測。具體為：無菌環境下取魚體肝臟，加入ddH2O 研磨并煮沸5 min，以轉速12 000 r/min離心2 min，取上清液并稀釋10倍作為LAMP 反應的模板。同時，將100 μL 的磷酸緩沖鹽溶液（PBS，濃度10 μmol/L，pH 7.4）腹腔注射入對照組魚，24 h 后取肝臟，經相同方法處理后作為LAMP反應的模板。

用建立的LAMP 檢測方法對上述30 份石斑魚肝臟組織樣品進行檢測，同時設置哈維氏弧菌Toic基因質粒標準品為陽性對照，ddH2O 為陰性對照，反應產物通過鈣黃綠素熒光顯色法和20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進行結果判定。同時參照1.2.9 節中的常規PCR擴增方法對30份樣品進行檢測，檢測結果使用20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

2 結果與分析

2.1 最佳引物組篩選

以哈維氏弧菌的基因組DNA為模板，用設計的3 套引物組進行LAMP 擴增反應，結果顯示Toic-2引物組的擴增效果最佳（圖1），因此選擇Toic-2 引物組作為哈維氏弧菌LAMP擴增反應的引物。

圖1 不同引物組的哈維氏弧菌LAMP擴增反應Fig.1 LAMP amplification reaction with different primers

2.2 LAMP反應體系優化

分別對鈣黃綠素混合液、Mg2+、dNTPs、甜菜堿、環引物及不同的外內引物比例進行LAMP 擴增體系的優化。結果顯示，當鈣黃綠素混合液濃度為100 μmol/L，Mg2+濃度為4 mmol/L，dNTPs 濃度為1.6 mmol/L，外內引物比例為1∶7，環引物濃度為0.8 μmol/L，甜菜堿濃度為6 mmol/L 時，特異性梯狀條帶最為清晰，且產物呈現亮綠色（圖2(A～F)）。

圖2 哈維氏弧菌LAMP擴增反應體系優化Fig.2 System optimization of LAMP amplification reaction for Vibrio harveyi

2.3 LAMP反應條件優化

2.3.1 反應溫度的優化 設置不同的反應溫度進行LAMP擴增反應。結果顯示，在所有選定的溫度下，均可擴增出特異性梯狀條帶，且產物均呈現亮綠色。另外，當溫度為62 ℃時，特異性梯狀條帶最清晰，因此哈維氏弧菌LAMP 擴增反應的最佳溫度為62 ℃（圖3）。

2.3.2 反應時間的優化 設置不同的反應時間進行LAMP 擴增反應。結果顯示，當擴增時間為30 min時，并未出現擴增反應；當擴增時間為35～60 min時，產物均出現特異性擴增，且呈現亮綠色；且在35 min 時，即可見LAMP 擴增反應的特異性產物，當擴增50～60 min 時，特異性條帶更加清晰、明亮（圖4），但結合實際應用，選擇50 min 為最優擴增時間。因此，哈維氏弧菌LAMP 擴增反應的最短時間為35 min，而最優擴增時間為50 min。

2.4 特異性檢測

以9 種弧菌屬菌株及1 種金黃色葡萄球菌的基因組DNA為模板，用優化后的哈維氏弧菌LAMP檢測方法進行擴增反應。結果顯示，僅哈維氏弧菌和陽性對照的擴增結果呈現清晰的梯狀條帶，其余9種細菌及陰性對照均未擴增出條帶，且有梯狀條帶的產物顏色均對應呈現出亮綠色（陽性），反之，無梯狀條帶的產物顏色則對應呈現出橙黃色（陰性），表明本研究建立的哈維氏弧菌LAMP 檢測方法具有良好的特異性，不與其他8 種弧菌菌株及金黃色葡萄球菌發生交叉反應（圖5）。

圖5 哈維氏弧菌LAMP擴增方法特異性檢測Fig.5 LAMP amplification for specific detection of Vibrio harveyi

2.5 靈敏度檢測

用梯度稀釋的哈維氏弧菌基因組DNA 作為模板，采用優化后的哈維氏弧菌LAMP檢測方法及常規PCR方法進行擴增反應。結果顯示，LAMP檢測方法對哈維氏弧菌的檢測靈敏度可達100 fg/μL（圖6(A)）；相比之下，常規PCR法的檢測靈敏度為1 pg/μL（圖6(B)）。由此可見，本研究建立的哈維氏弧菌LAMP檢測方法的靈敏度要比常規PCR檢測法高10倍。

圖6 哈維氏弧菌LAMP擴增方法及常規PCR法靈敏度檢測Fig.6 LAMP amplification and common PCR for sensitivity detection of Vibrio harveyi

2.6 哈維氏弧菌LAMP檢測方法的應用

為驗證本研究所建立的哈維氏弧菌LAMP檢測方法的實用性，本研究使用哈維氏弧菌感染15尾石斑魚，并應用該方法對采集的感染后的石斑魚肝臟組織樣品進行檢測。檢測結果顯示，感染的15份樣本均出現陽性擴增，且反應顏色與電泳檢測結果一致，均呈亮綠色（圖7(A)）。另外，檢測15 份健康未感染的石斑魚肝臟組織樣品的結果顯示，所有樣品均未出現陽性擴增，且反應顏色均呈橙黃色，表明這15份樣品均為陰性，未感染哈維氏弧菌（圖7(B)）。

圖7 哈維氏弧菌LAMP檢測方法在石斑魚中的應用Fig.7 Application of LAMP amplification method for detecting Vibrio harveyi in grouper

另外，用常規PCR 方法同樣檢測上述30 份樣品，結果顯示，15 份感染的樣品均擴增出單一的目的條帶，表明這些樣品均受到哈維氏弧菌的感染；反之，15 份未感染的健康組織樣品全部未擴增出條帶，說明樣品為陰性。由此可見，LAMP檢測法和常規PCR法的檢測結果符合率為100%（圖7）。

3 討論

哈維氏弧菌是石斑魚養殖中常見的病原菌之一，是引起石斑魚“爛尾病”的主要致病菌，也可嚴重威脅卵形鯧鲹、對蝦等其他重要水產動物的健康。鑒于哈維氏弧菌的高致病性、高致死率，加強該病原早期的快速診斷和篩查十分重要。本研究針對哈維氏弧菌的Toic基因設計LAMP 擴增引物，通過優化LAMP 擴增體系及反應時間、溫度，檢測優化后LAMP 擴增反應的特異性和靈敏度，成功建立一種哈維氏弧菌的可視化LAMP 快速檢測技術，并在石斑魚感染哈維氏弧菌的快速診斷中進行應用。

張靜等[18]根據哈維氏弧菌的ToxR基因建立一套針對哈維氏弧菌的LAMP 技術，其反應靈敏度較高，為1 fg/μL，但檢測時間為45 min。該技術采用的是SYBR Green I 顯色法，需在反應結束后開蓋加入SYBR Green I，一定程度上存在氣溶膠污染造成假陽性的風險。與之相比，本研究引入一對環引物，縮短了檢測時間，最低檢測時間僅為35 min，并且舍棄SYBR Green I，引入鈣黃綠素染料，避免開蓋可能產生氣溶膠污染的問題，大大降低假陽性的可能性。涂志剛等[19]根據哈維氏弧菌的ToxR基因建立一套針對哈維氏弧菌的Real-time LAMP 技術，檢測靈敏度為100 fg/μL，檢測時間為40 min，具備靈敏度高，檢測時間短等優點，但該技術需要借助熒光檢測儀器方能進行檢測。相較之下，本研究具有與其相當的靈敏度，更快的檢測時間，檢測結果肉眼可見且不需要借助復雜的儀器，僅需一臺恒溫水浴鍋即可完成檢測，更適合在生產一線進行臨床檢測。故對比前人建立針對哈維氏弧菌的LAMP快速檢測方法，本研究方法優點更為突出。

此外，與常規PCR 檢測方法相比，本研究建立的哈維氏弧菌可視化LAMP 快速檢測技術也有較多優勢。Pang 等[20]基于哈維氏弧菌toxR基因構建常規PCR快速檢測方法，從開始檢測到PCR 產物鑒定結束總時長約為2 h。本研究所建立的LAMP 技術可在簡單的恒溫水浴鍋中（62 ℃）進行反應，最快反應時間僅需35 min。因此相較于常規PCR 法，該方法不僅避免使用昂貴的PCR 儀，還可節約時間近1.5 h。另外，在反應開始前即向反應液中加入鈣黃綠素染料，當反應結束即可直接用肉眼對結果進行快速判定，這樣既可避免反應后開蓋加入染料導致的氣溶膠污染，大大減少假陽性結果的出現，又可代替瓊脂糖凝膠電泳分析實驗結果，具有較好的簡便性。同時，本研究采用LAMP檢測法對30份石斑魚感染哈維氏弧菌的組織樣品進行檢測，發現其檢測結果與預期結果及PCR 檢測結果的符合率均為100%。因此，本方法具有耗時短、特異性強、靈敏度高、儀器簡單、操作簡單、結果可視化等諸多優點，非常適合在生產現場進行哈維氏弧菌的快速檢測，為進一步推廣該技術在石斑魚及其他水生動物哈維氏弧菌感染監測中的現場大規模應用提供了有用的技術支撐。

4 結論

本研究以哈維氏弧菌外膜通道蛋白基因Toic為靶基因，以鈣黃綠素為檢測結果指示劑，通過對反應體系和反應條件進行優化，成功建立一種針對哈維氏弧菌的可視化LAMP 檢測方法。該方法的檢測時間最快為35 min，靈敏度為100 fg/mL，特異性強，與8種弧菌及金黃色葡萄球菌均無交叉反應，可準確地檢測到魚體組織中感染的哈維氏弧菌。綜上所述，本研究建立的LAMP 檢測方法是一種操作簡單、反應快速、特異性強、靈敏度高、結果可視化的檢測方法，且適用于石斑魚感染哈維氏弧菌的早期快速診斷。