狼瘡腎炎患者血清lncRNA TUG1、miR-144的表達及其意義

江丹,熊金河,尚華,汪佳利,何芳

狼瘡腎炎(lupus nephritis,LN)是系統性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)最常見和最重要的并發癥,40%～60%的SLE患者在發病初期即合并LN,是導致SLE患者發展為終末期腎病(end-stage renal disease,ESRD)和死亡的重要原因[1-2]。及時、準確地評估LN腎臟預后,對促進患者預后改善非常重要。炎性反應在LN發生發展中扮演重要角色[3],研究表明,長鏈非編碼核糖核酸(long non-coding ribonucleic acid,LncRNA)、微小核糖核酸(micro ribonucleic acid,miRNA)等非編核糖核酸能通過調控炎性反應參與LN發生發展[4]。lncRNA?；撬嵘险{基因1(taurine up-regulated gene 1,TUG1)是新近發現的一種lncRNA, lncRNA TUG1在SLE患者外周血中低表達[5]。miR-144是一種炎性相關miRNA,能通過影響靶蛋白穩定性和狀態發揮抗炎作用[6]。有學者指出,miR-144在免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)A腎病患者尿沉渣中高表達[7]。然而關于LN患者血清lncRNA TUG1、miR-144表達與預后的關系尚未明確,基于此,現分析LN患者血清lncRNA TUG1、miR-144表達與預后的關系,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年1月—2021年6月遂寧市中心醫院風濕免疫科收治的LN患者104例為LN組,男17例,女87例;年齡18～55歲,中位數26.00(19.00,34.00)歲;病程1～22年,中位數7.5(4.00,12.00)年;病理分型[8]:Ⅱ型8例,Ⅲ型20例,Ⅳ型24例,Ⅴ型28例,Ⅲ型+Ⅴ型11例,Ⅵ型+Ⅴ型13例;慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)分期[9]:1期40例,2期24例,3期28例,4期12例。另選取醫院同期體檢健康者40例為健康對照組,男7例、女33例;年齡18～55歲,中位數27.00(19.25,35.75)歲。2組性別、年齡比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。本研究已經獲得醫院倫理委員會批準(KYLLKS20230114) ,受試者或家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:① LN符合《中國狼瘡腎炎診斷和治療指南》[10]診斷標準;②年齡≥18歲;③行腎穿刺活檢術;④CKD分期1～4期。(2)排除標準:①藥物性狼瘡等繼發性LN;②確診時已經處于CKD分期5期ESRD或已經接受腎移植、透析治療;③合并惡性腫瘤;④合并類風濕性關節炎、紫癜、炎性腸病等其他自身免疫性疾病;⑤臨床資料和隨訪資料缺失;⑥妊娠及哺乳期婦女;⑦合并心、肝、肺等其他臟器嚴重功能損害。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血清lncRNA TUG1、miR-144表達檢測:收集LN患者入院次日和健康對照組體檢時靜脈血3 ml,離心留取上層血清置于-80℃冰箱中保存待測。使用生工生物工程(上海)股份有限公司(貨號B511321-0100)提供的TRIzol試劑盒提取血清總RNA,使用寶日醫生物技術(北京)有限公司提供的TaKaRa逆轉錄試劑盒(貨號 6160)將RNA逆轉錄為cDNA。然后使用賽默飛世爾科技(中國)有限公司生產的7500型聚合酶鏈式反應擴增儀,按照實時熒光定量聚合酶鏈式反應試劑盒(貨號 10928042)說明書進行擴增。由新貝(上海)生物科技有限公司設計和合成引物,反應總體積:cDNA 1 μl、上下游引物各2.5 μl、2×Hieff?Robust PCR Master Mix 10 μl 、ddH2O加至總體積25 μl ;循環參數:94℃ 3 min 1次,94℃ 10 s、55℃ 20 s、72℃ 30 s,共計35次。lncRNA TUG1上游引物5'-CTGAAGAAAGGCAATCCATC-3'、下游引物5'-GTAGGCTACTACAGGTCATTTG-3';GAPDH上游引物5'-GTCGGAGTCAACGGATTTG-3'、下游引物5'-TGGGTGGAATCATATTGGAA-3';miR-144上游引物5'-GCGCGCTACAGTATAGATGATG-3'、下游引物5'-GCTGTCAACGATACGCTACG-3';U6上游引物5'-CCATCGGAAGCTCGTATACGAAATT-3'、下游引物5'-GGCCTCTCGAACTTGCGTGTCAG-3'。lncRNA TUG1以GAPDH為內參,miR-144以U6為內參,2-ΔΔCT法計算血清lncRNA TUG1、miR-144相對表達量。

1.3.2 隨訪和分組:通過門診或電話方式對LN患者隨訪2年,隨訪截至2023年6月或ESRD發生。ESRD定義為估算腎小球濾過率(estimate glomerular filtration rate,eGFR)<1 5 ml·min-1·1.73 m-2或透析或腎移植[9]。根據是否發生ESRD將LN患者分為預后不良亞組和預后良好亞組。

2 結 果

2.1 2組血清lncRNA TUG1、miR-144表達比較 LN組患者血清lncRNA TUG1表達低于健康對照組,miR-144表達高于健康對照組(P<0.01),見表1。

表1 健康對照組與LN組血清lncRNA TUG1、miR-144表達比較

2.2 LN亞組患者臨床/病理特征比較 隨訪2年,LN患者104例中發生ESRD 36例(34.62%)。2亞組患者性別、年齡、腎穿刺時病程、并發疾病、病理分型等資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。預后不良亞組患者CKD 3～4期比例、血肌酐、血尿素氮、miR-144高于預后良好亞組,eGFR、lncRNA TUG1和誘導治療后完全緩解比例低于預后良好亞組(P<0.05或P<0.01),見表2。

表2 預后不良亞組及預后良好亞組LN患者臨床/病理特征比較

2.3 LN患者血清lncRNA TUG1與miR-144表達的相關性 經TargetScan網站預測,lncRNA TUG1與miR-144存在結合位點(見圖1)。Pearson相關性分析顯示,LN患者血清lncRNA TUG1與miR-144表達呈負相關(r=-0.797,P<0.001)。

圖1 lncRNA TUG1與miR-144的結合位點示意圖

2.4 LN患者預后不良的多因素Logistic回歸分析 以LN患者預后不良為因變量(賦值:是為“1”,否為“0”),以上述結果中P<0.05項目為自變量,進行多因素Logistic回歸分析,結果顯示,CKD分期4期和miR-144升高為LN患者腎臟預后不良的獨立危險因素,誘導治療后完全緩解和eGFR、lncRNA TUG1升高為獨立保護因素(P<0.05),見表3。

表3 LN患者預后不良的多因素Logistic回歸分析

2.5 血清lncRNA TUG1、miR-144表達預測LN患者腎臟預后不良的價值 繪制血清lncRNA TUG1、miR-144表達預測LN患者腎臟預后不良的ROC曲線,并計算AUC,結果顯示:血清lncRNA TUG1、miR-144表達與二項聯合預測LN患者腎臟預后不良的AUC分別為0.772、0.773、0.911,二項聯合預測的AUC最大(Z=3.239、3.247,P均=0.001),見表4、圖2。

圖2 血清lncRNA TUG1、miR-144表達預測LN患者腎臟預后不良的ROC曲線Fig.2 ROC curves of serum lncRNA TUG1 and miR-144 expression predicting poor renal prognosis in LN patients

表4 血清lncRNA TUG1、miR-144表達預測LN患者腎臟預后不良的價值

3 討 論

SLE是由環境、遺傳、性激素等多因素引起的一種系統性自身免疫性疾病,以體內存在大量自身抗體、反復復發與緩解、全身多系統多臟器受累為主要臨床特點,能通過循環、原位免疫復合物沉積途徑、非免疫復合物途徑或腎血管病變損傷引起腎臟損傷導致LN[10]。盡管近年來LN診治取得一定進展,患者預后得以較大的改善,但現階段誘導治療方案對增殖性LN完全緩解率仍然較低,且LN具有反復復發的特點,導致較多患者仍然會發展為ESRD,增加死亡風險[11]。LN異質性高,不同患者臨床表現、治療反應和預后具有個體差異,因此有必要尋找簡便方法對LN患者腎臟預后進行判斷,對促進LN患者腎臟預后改善具有重要意義。

研究證實炎性級聯反應在LN中發揮重要作用,SLE引起的循環免疫復合物或原位形成的免疫復合物沉積能激活補體系統,引起炎性細胞浸潤和炎性介質釋放,損傷腎小球足細胞、腎血管、腎小管間質等導致LN,隨著腎損害加重最終導致ESRD[12]。新近研究表明,表觀遺傳參與LN發生發展,其中lncRNA能直接或通過海綿miRNA調控基因表達,進而參與LN過程[13]。lncRNA TUG1是位于人染色體22q12.2上的一個lncRNA,既往研究多報道其在惡性腫瘤中的作用,近年研究發現lncRNA TUG1還在哮喘、潰瘍性結腸炎等免疫疾病中發揮重要作用[14-15]。盧發菊等[16]實驗報道,lncRNA TUG1能靶向miR-199a-3p減輕高糖誘導的足細胞炎性反應。Wang等[17]實驗報道,上調lncRNA TUG1能靶向核因子紅細胞2相關因子2/血紅素氧合酶1途徑減輕膿毒癥誘導腎臟炎性反應,進而抑制急性腎損傷發生。上述研究表明,lncRNA TUG1與腎臟損傷有關。同時既往Cao等[5]研究指出,SLE患者外周血lncRNA TUG1低表達。因此推測lncRNA TUG1可能參與LN過程。本研究結果顯示,LN患者血清lncRNA TUG1表達降低,血清lncRNA TUG1表達升高為LN患者腎臟預后不良的獨立保護因素,這說明血清lncRNA TUG1表達升高能降低LN患者腎臟預后不良風險。其原因可能是lncRNA TUG1高表達能靶向抑制核因子-κB信號通路活化,抑制腎臟炎性細胞浸潤和炎性介質釋放,避免炎性級聯反應對腎臟的損傷,從而降低LN患者腎臟預后不良風險[18]。

miRNA也是表觀遺傳的重要一環,能通過與靶基因完全或不完全互補調控基因表達,進而參與LN過程[19]。miR-144是位于人染色體17q11.2上的一個miRNA,是多種惡性腫瘤的抑制基因,近年研究發現miR-144也參與骨關節炎、類風濕性關節炎等免疫疾病過程[20]。Min等[21]實驗報道,上調miR-144能促進白介素- 1β、白介素-6、腫瘤壞死因子-α等炎性因子和B細胞淋巴瘤/白血病-2表達,進而促進腎細胞炎性反應和凋亡。Xu等[22]實驗報道,上調miR-144能激活Wnt/β-連環蛋白通路,進而促進大鼠腎細胞凋亡。上述研究表明,miR-144對腎臟具有重要的保護作用。重要的是,IgA腎病同LN一樣也屬于免疫性腎病,由免疫系統功能紊亂引起免疫復合物沉積于腎臟所致[23]。而Duan等[7]研究指出,IgA腎病患者尿沉渣中miR-144高表達。因此推測miR-144可能參與LN過程。本研究結果顯示,LN患者血清miR-144表達升高,為LN患者腎臟預后不良的獨立危險因素,這說明血清miR-144表達升高會增加LN患者腎臟預后不良風險。其原因可能是miR-144高表達能激活Wnt/β-連環蛋白通路,導致免疫系統紊亂,促進腎臟炎性細胞浸潤和炎性介質釋放,加重腎臟功能和結構破壞,進而增加LN患者腎臟預后不良風險[24]。

本研究通過網站預測發現,lncRNA TUG1與miR-144存在結合位點,進一步分析發現lncRNA TUG1與miR-144在LN患者血清中表達呈負相關,提示lncRNA TUG1與miR-144可能共同影響LN病情進展。最近馬洪波等[25]實驗也報道,上調lncRNA TUG1能靶向吸附miR-144,進而抑制LN小鼠腎小球系膜細胞炎性反應,進一步佐證了本研究結果。本研究結果還顯示,CKD分期4期、誘導治療后完全緩解和eGFR也能獨立影響LN患者腎臟預后,其原因可能是CKD分期4期和eGFR降低反映LN患者腎臟損傷更嚴重,因此腎臟預后不良風險更高;誘導治療后完全緩解提示誘導治療對LN有效,能更好地抑制炎性反應發展,進而降低腎臟預后不良風險。最后本研究通過繪制ROC曲線發現,血清lncRNA TUG1、miR-144表達為0.55、1.38時,預測LN患者腎臟預后不良的AUC為0.772、0.773;血清lncRNA TUG1、miR-144表達聯合預測的AUC為0.911,大于lncRNA TUG1、miR-144單獨預測。說明檢測血清lncRNA TUG1、miR-144表達有助于LN患者腎臟預后不良預測,且聯合檢測血清lncRNA TUG1、miR-144表達能提升預測價值。但本研究結果還需多中心研究進一步驗證。

綜上所述,LN患者血清lncRNA TUG1表達降低,miR-144表達升高,二者可能共同影響LN腎臟預后,是LN患者腎臟預后不良的獨立影響因子。血清lncRNA TUG1、miR-144表達聯合檢測對LN腎臟預后不良的預測價值較高。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

江丹、何芳:設計研究方案,實施研究過程,論文撰寫;熊金河、尚華:提出研究思路,分析試驗數據,論文審核;汪佳利:進行統計學分析