氧化應激指標、血管內皮損傷與慢性腎病患者磷脂酰絲氨酸外翻的關系

賈英民,張軼斐,劉鵬,李長新,常靜,戴浩然,劉偉敬,劉寶利

慢性腎病(chronic kidney diseases,CKD)是由于各種腎臟疾病導致自身腎功能不可逆轉的下降,我國和世界范圍內CKD的發病率逐年增加,已成為嚴重危害人類健康的全球性公共衛生問題。腎臟容易受到氧化還原失衡和氧化應激的影響。氧化應激在腎臟疾病進展中發揮著重要作用,與水鈉潴留、腎血流量變化、蛋白尿、腎組織纖維化密切相關,大量研究表明,氧化應激水平升高可引起腎功能惡化,導致腎臟內皮細胞損傷。細胞磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine, PS)是一種主要位于內膜小葉中帶負電荷的氨基磷脂,暴露在質膜外小葉上的PS可對各種刺激作出反應,或在囊泡生成過程中參與各種疾病的進展,與炎性反應、氧化應激和細胞凋亡密切相關。當疾病進展到CKD 第5期時,此階段由于腎功能的降低或缺失會出現體液潴留、貧血、骨礦物質代謝紊亂、血脂異常和蛋白質能量營養不良等并發癥,又被稱為終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD),臨床中常需要依賴腎臟替代治療以維持生命。目前我國大多數ESRD患者需要進行腹膜或血液透析(hemodialysis, HD)治療,其中建立自體動靜脈內瘺(native arteriovenous fistula, AVF)是ESRD患者進行長期血液透析的首選方式[1-2]。CKD5期患者血管內皮損傷對于AVF的建立、成熟和臨床應用影響重大。研究發現[3],氧化應激反應可加重血管內皮損傷,同時可觀察到細胞PS外翻增加。因此,本研究探討CKD患者中PS外翻、氧化應激與血管內皮損傷的表達,分析其相關性,有助于了解CKD患者病情程度并判斷預后,對于血液透析患者則有利于減少AVF的臨床并發癥及延長AVF使用時間,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 參照“腎臟病預后質量倡議”(KDOQI)和“改善全球腎臟病預后”(KDIGO)工作組制定的CKD指南的診斷標準[4-5],選取2019年1月—2021年12月在北京中醫醫院順義醫院門診及病房診斷為CKD 2～5期患者88例。其中男 50例,女 38例,年齡33～75(54.59±20.71歲);原發病:糖尿病腎病38例(43.18%),慢性腎小球腎炎19例(21.59%),高血壓腎病19例(21.59%),慢性腎盂腎炎、梗阻性腎病、缺血性腎病、心腎綜合征、多囊腎、淀粉樣變腎病各2例(各占2.27%);根據估算的腎小球濾過率(eGFR)將其腎功能損傷的病情分為重、中、輕度3組,符合CKD 5期(重度)患者(eGFR<15 ml·min-1·1.73m-2)53例、CKD 4期(中度)患者(15

1.2 病例納入及排除標準

1.2.1 納入標準:(1)血清組:①符合慢性腎臟病診斷標準,CKD分期2～5期患者;②年齡在18～75歲。(2)AVF手術組:①符合慢性腎衰竭臨床診斷標準;②年齡在18～75歲;③GFR<30 ml·min-1·1.73m-2,決定選擇HD治療;④eGFR<15 ml·min-1·1.73m-2、血清肌酐>528 μmol/L或糖尿病腎病患者eGFR<25 ml/(min·1.73m2)、血清肌酐>352 μmol/L,預計6個月內需進入HD治療;⑤尿毒癥癥狀明顯,支持治療難以控制者;⑥ESRD已經進入規律血液透析患者;⑦血管條件符合動靜脈內瘺手術條件者。

1.2.2 排除標準:(1)心力衰竭未能控制;(2)血管條件差,中心靜脈或近心端大靜脈存在嚴重狹窄等;(3)凝血功能嚴重異常;(4)手術部位有感染及燒燙傷等;(5)前臂Allen試驗陽性;(6)患者預期存活不超過6個月;(7)其他不能配合手術者。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 血生化指標檢測:采集患者空腹外周靜脈血4 ml,室溫靜置30 min,后3 000 r/min離心10 min,收集上層血清,全自動生化儀檢測血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)及尿酸(UA)水平。

1.3.2 氧化應激指標檢測:上述血清,運用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血清中超氧化物歧化酶(supero-xide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPx)(購自北京聚合美生物科技有限公司),內皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)等氧化應激反應指標。試驗步驟嚴格按照酶聯免疫吸附測定試劑盒(購自英國abcam)說明書步驟操作。

1.3.3 血液血管內皮功能檢測:上述血清運用酶聯免疫吸附法(ELISA)測定血管內皮細胞生長因子(VEGF)和PS的表達。試驗步驟嚴格按照酶聯免疫吸附測定試劑盒(購自英國abcam)說明書步驟操作。

1.3.4 靜脈血管內皮功能檢測:采集自體動靜脈內瘺制作手術中所修剪的靜脈血管和肢體外傷患者及肢體外科手術中所取得的靜脈血管,將這些靜脈血管固定、石蠟包埋后進行免疫組化處理。小鼠抗人VEGF、血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)、SOD-1、GPx-1/2單克隆抗體購自Santa Cruz公司,PV8000染色試劑盒(內源性過氧化物酶阻斷劑、超氧酶標山羊抗鼠/兔IgG聚合物、DAB濃縮液、DAB稀釋液購自北京中杉金橋公司)。采用PV-8000通用型二步免疫組化法:將蠟塊切片,72℃烤片,常規脫蠟至水,高壓EDTA 8.0修復2.5 min,PBS清洗,3% H2O2阻斷15 min,PBS清洗,加適量稀釋的一抗(VEGF 1∶50、VEGFR2 1∶50、SOD-1 1∶50、GPx-1/2 1∶25),37℃孵育1 h,加二抗37℃孵育20 min,DAB顯色約3 min,蘇木素復染,脫水透明,中性樹膠封片。以PBS代替一抗設立陰性對照,以人VEGF、VEGFR2、SOD-1、GPx-1/2陽性的未伴有腎臟病肢體外傷及肢體外科手術患者為陽性對照。對SOD-1、GPx、VEGF、VEGFR2(購自北京聚合美生物)表達進行檢測,以陽性細胞數量為觀察指標,對細胞的染色深淺程度及著色數量進行評估。

2 結 果

2.1 各組CKD患者年齡、病程和腎功能指標比較 在各項臨床資料信息中,3組患者的年齡、病程和血清SCr、BUN、UA等隨病情嚴重而升高,且差異具有統計學意義(P<0.01),見表1。

表1 3組CKD患者一般資料及腎功能指標比較

2.2 各組CKD患者血清氧化應激指標比較 3組患者的MDA、eNOS水平隨病情嚴重而升高,SOD、GPx表達隨病情進展而下降,差異具有統計學意義(P<0.01或0.05),見表2。

表2 各組CKD患者氧化應激、PS外翻和VEGF表達情況比較

2.3 各組患者血清VEGF、 PS外翻結果比較 3組患者血清VEGF、PS隨病情加重而升高,組間差異具有統計學意義(P<0.01),見表2。

2.4 AVF組與正常對照組靜脈組織中SOD-1、GPx、VEGF、VEGFR2的免疫組化染色表達比較 血管內皮細胞免疫組化染色后,細胞核染呈藍色,胞膜和胞漿染根據染色強度呈黃色或棕褐色。通過光鏡下觀察陽性細胞著色數量及程度進行評判,在正常對照組中SOD-1、GPx、VEGF、VEGFR2均呈弱表達(見圖1);在進行AVF手術的ESRD患者中,SOD-1、GPx、VEGF、VEGFR2表達點主要位于細胞漿,部分還定位于胞膜(見圖1),SOD-1、GPx、VEGF、VEGFR2均呈高表達。

2.5 CKD-5期患者氧化應激因素與PS外翻及血管內皮細胞損傷之間的線性回歸分析 將血清標本中CKD-5期所測得的PS暴露水平與MDA、SOD、GPx、eNOS水平進行多元線性回歸分析,將PS暴露水平及4個氧化應激指標與VEGF表達水平進行單因素回歸分析,結果表明PS暴露水平與SOD、GPx表達呈負相關(P<0.01),與MDA、eNOS表達呈正相關(P<0.01);VEGF表達與MDA、eNOS表達呈正相關,與SOD、GPx表達呈負相關(P<0.01);PS暴露水平與VEGF表達呈正相關(P<0.01),見表3。

表3 PS外翻水平與氧化應激因素及血管內皮細胞損傷的相關性分析

2.6 氧化應激指標與內皮細胞損傷對PS外翻的預測價值 以PS未外翻患者作為陰性樣本,PS外翻陽性患者作為陽性樣本,繪制ROC曲線,結果表明SOD、GPx、MDA、eNOS、VEGF預測PS外翻的AUC分別為0.819、0.818、0.735、0.824、0.892,見表4、圖2。

圖2 CKD患者血清SOD、GPx、MDA、eNOS、VEGF預測PS外翻的ROC曲線Fig.2 ROC curve of serum SOD, GPx, MDA, eNOS, and VEGF predicting PS valgus in CKD patients

表4 SOD、GPx、MDA、eNOS、VEGF預測PS外翻相關模型AUC比較

3 討 論

在我國CKD的發病率呈現持續上升趨勢,約有10.8%成年人患有CKD,其中每年約1%的患者進入ESRD階段,需要通過腎臟替代治療才能維持生命[6-7]。研究表明[8],氧化應激與腎小球濾過率呈負相關,進展到ESRD階段的患者,其腎功能伴隨著氧化應激狀態的增強而惡化,其氧化應激的產生與慢性炎性反應增加,抗氧化能力減弱,晚期糖基化引起的腎小球穩態紊亂,透析治療引起補體途徑激活及中性粒細胞活化等因素有關。而氧化應激使活性氧(reactive oxygen species, ROS)聚集,可通過多條通路加劇腎臟炎性反應,促進細胞外基質(ECM)沉積,增加血管通透性,改變腎臟血流狀態,引起小管上皮細胞凋亡,小管間質纖維化以及足細胞、系膜細胞、內皮細胞的損傷等病理改變,進而加重腎臟病情[9]。CKD患者的氧化應激狀態又表現為多種氧化損傷標志物水平的增加以及抗氧化防御能力的平行降低。MDA是脂質過氧化標志物之一,當自由基等氧化劑攻擊脂質時可出現增高。GPx、SOD作為重要的抗氧化酶,可阻止羥自由基的產生并抵消脂質過氧化的毒性作用,當機體氧化應激水平增高時,二者表達下降[10]。本研究同樣發現,CKD患者血清氧化應激水平隨著病情程度的加重而顯著增強,其中既包括過氧化產物MDA明顯升高,還包括抗氧化的SOD和GPx水平降低。

在腎臟替代治療中,AVF被認為是最理想的永久性血液通路,故血管內皮細胞(vascular endothelial cells, VECs)與ESRD關系密切[11]。VECs由單層扁平細胞或多角形細胞構成,是位于血流與血管平滑肌細胞之間的屏障。血管作為高代謝率器官,VECs具有調節血管張力、炎性反應修復、抗凝促纖等作用,可感應血流中氧氣含量、剪切應力、滲透壓和炎性反應激素等局部微環境的變化而發生改變。VECs作為循環系統的重要組成部分,氧化應激可引起VECs功能障礙,研究表明[12]接受替代治療的患者中,心血管疾病是導致死亡的主要原因,占該類患者死亡人數的40%以上。eNOS主要存在于內皮細胞中,具有降低VECs黏附性,調節血管張力的作用[13],病理狀態下,eNOS結構解偶聯并與氧分子相互作用生成超氧陰離子,引起ROS增多,使氧化應激增強并引發內皮功能障礙,二者可互相加重[14]。VEGF具有促進VECs增殖、增加血管通透性、刺激新生血管形成的作用,正常人中VEGF 水平較低,而在透析患者中出現高表達。本研究同樣得出eNOS與VEGF均可隨著病情加重而增高的結論,表明終末期腎臟病患者內皮細胞功能紊亂,而Pearson相關性分析亦證實氧化應激增強則是引起血管內皮損傷的重要機制。

PS由磷脂酰膽堿或磷脂酰乙醇胺通過Ca2+依賴性堿基交換反應合成,其中預先存在的磷脂的極性頭部基團被絲氨酸取代[15]。PS作為細胞質膜重要的磷脂成分之一,廣泛存在于紅細胞、血小板、內皮細胞等真核細胞當中[16]。生理條件下,質膜中的PS在能量依賴機制作用下,通過P4-ATP酶(PS翻轉酶)的調節將PS從外質集中到細胞質內小葉中,而磷脂干擾酶則可將細胞膜內外的磷脂進行非特異性轉運,二者共同維持磷脂的這種不對稱分布[17]。在細胞凋亡或胞內出現ATP供能不足、Ca2+水平升高等病理條件時,細胞膜的這種不對稱性發生了破壞,導致了質膜PS外翻[18]。PS外翻在細胞凋亡中優先作為吞噬細胞的識別信號[19],又能作為引信信號成為趨化因子的適配器[20],可以說PS外翻是凋亡細胞的普遍特征。研究表明[21],PS可作為細胞色素C(cytochrome C,Cyt C)的靶標參與細胞凋亡,在凋亡過程中Cyt c從線粒體上分離,并伴有細胞內電子傳遞的中斷,從而使細胞凋亡常伴隨著ROS的產生。現已證實[21],由氧化劑誘導的細胞凋亡可導致不同類型的磷脂和PS氧化,可以說PS的氧化修飾是凋亡程序的一個組成部分[22],所以在細胞凋亡過程中PS的氧化和外翻相互協作,均是細胞凋亡程序的內在特征,其中PS氧化先于PS外翻并促進PS外翻[21],氧化的PS可增強巨噬細胞對PS外翻細胞的吞噬[23-24]。本研究結果同樣發現,SOD、GPx、MDA、eNOS與PS外翻具有較強相關性,表明CKD中氧化應激增強可引起PS外翻。同時PS 還是凝血啟動的重要信號分子,血小板活化可引起PS外翻,PS外翻加速了凝血因子FX激活和凝血酶生成,從而激活凝血級聯反應[25-26]。研究表明[27-28],通過PS與CXCL16/SRPSO的相互作用,可促進紅細胞表面的PS與內皮細胞黏附,結合在內皮上的紅細胞可干擾微循環,阻礙正常血運,而外翻的紅細胞PS可進一步與血小板結合,同樣內皮細胞的PS外翻也可成為與白細胞結合位點,使凝血酶原復合物形成,從而進一步導致血栓、炎性反應等級聯反應。此外,PS還可由膜微粒(membrane microparticles, MPs)表達,MPs是在細胞活化和細胞凋亡時由內皮細胞和血細胞脫落而形成的膜囊泡。CKD患者引起氧化應激介導的內皮細胞凋亡,導致內皮細胞微粒釋放[28],內皮微粒增多既增強PS暴露,還是內皮功能障礙的標志[29],符合本研究得出的PS外翻與血管內皮細胞的損害具有較強正相關的結果。

綜上所述,PS外翻可損傷內皮細胞,加重細胞凋亡,并促進血栓形成和炎性反應等病理作用。CKD患者普遍存在高氧化應激狀態,過多的ROS聚集可損傷血管內皮細胞,增強PS外翻,對于ESRD患者,可影響其AVF功能,造成AVF血栓形成導致AVF失功,從而加重腎損害。因此,探討氧化應激、血管內皮損傷與PS外翻相關性的研究,可為進一步延長ESRD患者AVF使用壽命、減少心血管事件、降低患者死亡率提供新的治療思路。

(致謝:感謝中日友好醫院李平教授對論文研究思路及修改方面提出的意見與建議)

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

賈英民:設計研究方案,實施研究過程,分析試驗數據、論文撰寫、修改;張軼斐:分析實驗數據,進行統計學分析,論文修改;劉鵬:設計研究方案、論文修改;李長新:病理資料分析;常靜、戴浩然:臨床資料整理;劉偉敬、劉寶利:提出研究思路,指導實施研究過程