2022 年山東地區商品肉雞15 株H9N2亞型禽流感病毒HA 基因的遺傳演化分析

邵明辰，董偉峰，劉兆潔

（1.山東省魯南牧工商有限公司，山東 棗莊 277500；2.山東省萊州市文昌路畜牧獸醫站，山東 萊州 261499；3.廣東省華晟生物技術有限公司，廣東 廣州 511400）

H9N2 是A 型流感病毒的一個亞型，具有高度空氣傳播性，可引發商品肉雞流感，同時該病毒還嚴重影響人類公共衛生安全。我國自1998 年就開始進行H9N2 亞型禽流感病毒（AIV）的防疫，但目前其疫苗株與流行株的抗原性已經出現了較大的差異[1]。商品肉雞因養殖密度大、通風不良等原因，冬春季極易引起流行，造成生產中的嚴重損失。雖然H9N2 亞型流感病毒屬于低致病性，但與大腸桿菌、支原體等混合感染后可引起免疫抑制和死亡增多，造成肉雞養殖業的巨大經濟損失[2]。

H9N2 禽流感病毒自1966 年首次在美國分離后，逐漸在北美、亞洲、中東、非洲和歐洲許多國家家禽體內發現，根據地理位置不同可分為北美和歐亞兩個體系。目前該病在亞洲地區分布較廣。

1994 年我國廣東地區首次公開報道H9N2 亞型禽流感病毒。 HA 基因是A 型流感病毒致病性的主要影響因子。 根據HA 序列，將H9N2 分為h9.1～h9.4，共4 個主干進化分支。當前，我國流行的主要為h9.4.2.5 和h9.4.2.6 兩個分支，但仍以h9.4.2.5 為主。本文選取了來自山東地區發病商品肉雞分離的15 株H9N2 禽流感病毒，用特異性引物對HA 基因進行擴增并測序，比對其HA 基因同源率，探討HA 基因遺傳演化特點，為商品肉雞低致病性禽流感H9N2 的防控提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 毒株

15 株H9N2 亞型商品肉雞分離株由廣東省華晟生物技術有限公司分離鑒定保存，方法參照文獻[3]，并分別命名為A/CK/SD/11/2022/H9N2、A/CK/SD/15/2022/H9N2、A/CK/SD/16/2022/H9N2、A/CK/SD/17/2022/H9N2、A/CK/SD/19/2022/H9N2、A/CK/SD/21/2022/H9N2、A/CK/SD/29/2022/H9N2、A/CK/SD/30/2022/H9N2、A/CK/SD/31/2022/H9N2、A/CK/SD/32/2022/H9N2、A/CK/SD/50/2022/H9N2、A/CK/SD/51/2022/H9N2、A/CK/SD/52/2022/H9N2、A/CK/SD/53/2022/H9N2、A/CK/SD/54/2022/H9N2。

H9-2203-C（4.2.5c）、HeB210813-2F6-b（4.2.5b）、H9-2102-a（4.2.5a）參考毒株HA 序列由華南農業大學獸醫學院提供。

1.2 主要材料和試劑

SPF 雞（胚）由廣東新興大華農禽蛋有限公司提供。試驗所用分子生物學試劑購自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3 引物合成

利用參考文獻[3]中的H9N2 禽流感病毒HA基因引物序列，由廣州核源生物科技有限公司合成，用于擴增HA 基因全長序列，預期擴增的HA基因大小為1 687 bp。擴增所用引物序列詳見表1。

表1 擴增所用引物序列

1.4 病毒RNA 的提取及RT-PCR 擴增、測序

參照試劑盒說明書進行病毒RNA 提取。RTPCR 擴增、連接克隆、序列測定參照文獻提出的方法進行[4]。

1.5 遺傳進化分析

15 株分離毒株、8 株H9N2 禽流感參考毒株的HA 基因序列（表2）以及華南農業大學獸醫學院提供分型的3 株H9N2 毒株HA 基因序列，用MEGA6.0 進行遺傳演化分析，繪制系統進化發育樹。

表2 8株H9N2禽流感參考毒株的HA基因序列信息

2 結果

2.1 HA 基因的同源性和遺傳分析

將11 株（8+3）參考毒株與15 株H9N2 病毒分離株的HA 基因進行遺傳演化分析，獲得如圖1 所示的進化樹。

圖1 HA基因遺傳進化樹

從圖1 進化樹可以看出，15 株分離毒株均屬于4.2.5 分支，細分為2 個亞分支。其中，12 株分離毒株屬于4.2.5c 分支，3 株分離毒株屬于4.2.5a分支。圖2 中，15 株H9N2 分離毒株之間的HA序列相似性在93.3%～99.9%之間。同一亞分支4.2.5a 分支間的毒株相似性在99.8%～99.9%之間，4.2.5c 分支間的毒株相似性在95.6%～99.9%之間，差異較小，但不同亞分支間的毒株相似性差異較大。根據以往經驗，相似性差異大于1.5%就能形成分支間的差異，因此分析這些毒株的抗原性可能也會存在明顯差異。

圖2 HA基因核苷酸同源率

2.2 關鍵位點分析

15 株分離株的HA 裂解位點呈現弱毒株的序列特征，均為RSSR ↓GLF。受體結合位點分析發現W161 和G236 符合其絕對保守氨基酸位點的特征，沒有出現其他氨基酸的突變。12 株病毒（11/15/16/17/19/30/50/51/52/53/54）在163 位點為N 突變，3 株病毒（29/31/32）在163 位點為T 突變，198 位點均為V 突變。所有分離株存在234L和236G（表3）。以上突變位點均與受體特異性相關，說明所有分離株都有感染哺乳動物的風險。

表3 HA基因關鍵位點分析

3 討論

流感病毒的HA 基因裂解位點氨基酸序列是其致病性和毒力的主要影響因子[5]。本研究中15個H9N2 分離毒株的HA 基因裂解位點具有低致病性流感病毒分子特征，裂解位點氨基酸序列為RSSR ↓GLF，沒有連續的多個堿性氨基酸插入。

測序鑒定的15株H9N2毒株均屬于4.2.5分支，此分支是當前國內商品肉雞H9N2 病毒的主要流行分支。病毒分布在4.2.5 分支內部的2 個亞分支中，2 個分支之間病毒的HA 基因存在明顯的相似性差異，暗示病毒的抗原性之間也可能存在較大差異。Sun 等[6]發現，H9N2 病毒流行株同源性之間呈現時間和地理位置的一致性；不同的是，較早期病毒均有不同程度的變異和進化。本研究中，通過對15 株H9N2 分離毒 HA 基因進化樹分析可知，從地理位置上分離毒呈現出兩種不同的同源性關系，從分支上隸屬于4.2.5a 和4.2.5c 亞分支，出現了地理位置的不一致性。當前國內商品肉雞使用的H9N2 滅活疫苗基本是單一毒株，抗體交叉可能存在差異，提示肉雞場需要兼顧兩種不同亞分支毒株的免疫。

H9N2 禽流感病毒對公共安全也有潛在威脅[7]。15 株分離毒株的HA 基因關鍵位點突變均呈現出典型的人流感受體結合特性，具有234L和236G 的特征，以上突變位點均與受體特異性相關，病毒均具備感染哺乳動物的風險，提示相關從業人員應該加強生物安全防護，避免其產生嚴重的公共危害。