西南地區野生刺梨的遺傳多樣性和遺傳結構研究
2023-12-19 02:09:34吳詩琪
廣西植物 2023年11期
吳詩琪, 潘 鳳, 趙 財
( 貴州大學 生命科學學院/農業生物工程研究院, 山地植物資源保護與保護種質創新教育部重點實驗室, 貴陽 550025 )
隨著社會生活質量的不斷提高,人們越來越重視食物的營養價值。不僅如此,人類對綠色生活和綠水青山的需求更加迫切,因此需要開發利用更多優質的野生植物資源。刺梨(Rosaroxburghii)為薔薇科,薔薇屬重要植物資源。原產中國西南部,特別以貴州省資源最為豐富,湖南、湖北、甘肅、陜西和華東有零星分布,是我國特有的果樹資源(李楠玉等,2021)。因含有極高的維生素C成分而備受關注,其維生素C的含量比獼猴桃高9倍,被稱為 “維C之王”,因此深受消費者青睞。刺梨具有巨大的開發利用價值和經濟價值。其果實肉質肥厚且具有濃烈的特殊香氣,包含豐富的超氧化物歧化酶、過氧化物酶、多酚、刺梨黃酮、刺梨多糖、刺梨三萜、氨基酸以及微量元素等物質(張懷山等,2017)。同時,刺梨的藥用價值高,其花、果、葉和籽均可入藥,有清熱降火、健胃、消食、滋養、潤肺止咳和止瀉等效果,尤其是刺梨含有豐富的超氧化物歧化酶,在心血管、消化系統和各種腫瘤疾病等防治方面的應用十分廣泛(汪凱莎,2015)。因此,刺梨成為貴州省重點發展的果樹行業。隨著刺梨利用范圍的不斷擴展,相關研究也不斷豐富,主要集中在化學成分以及藥理作用等方面(饒浠銳等,2022)。但是,近年來,新型城市化進程加劇造成的土地侵占,以及土地開墾,農業耕種時的濫砍濫伐等造成的生態損壞和生境破碎化,野生刺梨的種群數量和分布面積呈現下降趨勢(李楠玉等,2021)。這一綠色資源并沒有得到很好的開發利用,當務之急就是對野生刺梨資源做好收集和遺傳背景分析及保護性利用等方面的管理工作(魯敏等,2020)。
目前,分子標記技術已廣泛運用于研究植物的遺傳多樣性,但刺梨種質資源分子水平的研究起步較晚。文曉鵬和鄧秀新(2003)通過形態學性狀和RAPD標記探索了刺梨及部分近緣種的親緣關系,并對不同自然分布區的30個野生刺梨進行遺傳多樣性分析,結果表明來自貴州的樣品蘊藏有最豐富的遺傳多樣性;鄢秀芹(2015)通過轉錄組測序獲得刺梨大量功能基因組信息,開發了其EST-SSR標記,并利用開發的引物進行刺梨及薔薇屬種質資源的遺傳多樣性分析;魯敏等(2017)基于EST-SSR標記構建貴州刺梨核心種質;張懷山(2017)利用SSR標記、ITS序列以及5個葉綠體基因對野生刺梨居群進行遺傳結構及遺傳多樣性分析;魯敏等(2020)對西南地區12個居群構建刺梨核心種質。綜上表明,刺梨起源于西南地區,但遺傳背景研究存在所使用標記遺傳信息量少,采集樣本數量較少,地域性相對狹窄問題,未能詳細闡明刺梨的遺傳多樣性,地理分布格局和起源問題等。
單拷貝基因(scnDNA)是雙親遺傳,攜帶大量的遺傳信息,屬于直系同源,可以更好地反映物種的進化史(畢毓芳等,2019)。近年來葉綠體基因(cpDNA)逐漸受到廣泛應用,其特點是分子量小、序列較為保守、進化遲緩、結構單一、單親遺傳,并且不易受外界環境影響(樊守金和郭秀秀,2022),可以用來揭示物種應對環境變化的進化潛力,對其遺傳多樣性的保護以及保護計劃的制訂實施都具有非常重要的價值(劉海瑞等,2018)。將二者結合分析可以更好地開展物種遺傳多樣性研究,使結果更加準確。
本研究采用2個單拷貝核基因(GAPDH和ncpGS)和進化速率較快的3個葉綠體基因間隔區atpF-trnH、trnL-trnF和trnG-trnS序列結合對分布西南地區的5個省市,27個居群共320個野生刺梨材料進行分析。采用群體遺傳學和譜系地理學的研究方法,探討野生刺梨居群遺傳多樣性和遺傳格局,種群歷史動態,并探究野生刺梨的起源演化歷史進程,為刺梨的資源保護和遺傳育種提供科學參考資料。同時,也為西南地區植物區系演化和物種形成機制研究奠定一定的基礎。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
本研究的320個刺梨材料采自貴州省、四川省、云南省、重慶市和湖北省共5個省市,覆蓋了整個西南地區的27個自然居群(表1)。根據當地的分布規模決定居群的樣本數量,每個居群采樣5～18個不等,單個樣本間距離50 m以上(圖1)。每株采取新鮮幼嫩的葉片10～20 g,將采集好的葉片就地迅速保存于采集袋中,加入硅膠進行干燥保存,后用于DNA提取。所采集的憑證標本存放于貴州大學生命科學學院中。
1.2 DNA提取、PCR擴增及測序
采用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因組DNA試劑盒(DP305)提取刺梨DNA。利用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA是否提取成功。3段葉綠體基因序列(atpF-trnH、trnL-trnF和trnG-trnS)和2段單拷貝核基因(GAPDH和ncpGS)分別通過5段引物進行PCR擴增(表2)。PCR擴增反應為25 μL 體系:2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL;上游引物、下游引物和DNA各1 μL;dd H20 9.5 μL。擴增后得到的PCR產物經2%的凝膠電泳檢測后將凝膠成像系統上有清晰、明亮條帶的樣品送往北京擎科生物科技有限公司(重慶分公司)進行純化及測序。
對于單拷貝核基因ncpGS序列所使用的反應程序:預變性94 ℃ 5 min,變性95 ℃ 45 s,退火51 ℃ 45 s,延伸72 ℃ 2 min,循環34次,最后延伸72 ℃ 10 min,12 ℃恒溫保存。GAPDH序列所使用的反應條件:預變性94 ℃ 4 min,變性95 ℃ 50 s,退火57 ℃ 50 s,延伸72 ℃ 2 min,循環34次,最后延伸72 ℃ 10 min,12 ℃恒溫保存。對于葉綠體基因atpF-trnH序列所使用的反應程序:預變性94 ℃ 5 min,變性94 ℃ 50 s,退火55 ℃ 50 s,延伸72 ℃ 1 min,循環34次,最后延伸72 ℃ 10 min,12 ℃恒溫保存。trnL-trnF序列所使用的反應條件:預變性96 ℃ 5 min,變性94 ℃ 40 s,退火54 ℃ 40 s,延伸72 ℃ 1 min,循環35次,最后延伸72 ℃ 10 min,12 ℃恒溫保存。trnG-trnS序列所使用的反應程序:預變性85 ℃ 5 min,變性95 ℃ 1 min,退火54 ℃ 1 min,延伸72 ℃ 2 min,循環34次,最后延伸72 ℃ 10 min,12 ℃恒溫保存。
1.3 數據處理與分析
獲得測序結果后,用Mega 6軟件(Tamura et al., 2013)刪掉序列兩端不可靠的堿基序列后進行比對,使用BioEdit軟件(Ahmed, 2011)查看測序峰圖,將序列進行手工校正得到比對好的數據后,利用PhyloSuite軟件(Zhang et al., 2020)將兩個單拷貝核基因以及3個cpDNA片段分別拼接成一個整體的長片段。采用DnaSP 6軟件(Rozas et al., 2017)對27個刺梨居群進行DNA多態性分析,得到相關所示數據,如單倍型數量(H)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)、變異位點(Vs)、簡約信息位點(Ps)。進行中性檢驗得到Tajima’sD值和Fu’sFs值,看結果是否符合中性進化模型,從而判斷是否曾經發生過擴張現象;以及進行錯配分析,觀察曲線進一步分析居群是否經歷過擴張或瓶頸效應(張曉蕓等,2019)。用PERMUTCpSSR軟件(Caraux & Pinloche, 2005)計算遺傳分化系數NST和GST。利用Arlequin軟件(Excoffier & Lischer, 2010)進行分子方差分析(AMOVA),計算刺梨居群內和居群間的遺傳變異,并計算遺傳分化系數(FST)揭示群體間遺傳結構, 基因流(Nm)進一步表明居群的分化水平。利用Mega 6軟件(Tamura et al., 2013)計算遺傳距離矩陣,利用Network軟件(Bandelt et al., 1999)基于簡約性原則采用MJ法構建單倍型網絡圖(潘鳳等,2021);用ArcGis軟件(張智慧,2017)繪制單倍型在地理上的分布。
圖 1 刺梨采樣照片Fig. 1 Photos of collected Rosa roxburghii
表 1 27個刺梨居群的采集信息Table 1 Collection information of 27 Rosa roxburghii populations
表 2 引物名稱、序列及參考文獻Table 2 Primer name, sequence and reference
表 3 320個刺梨材料基于單拷貝核基因和葉綠體基因的多態分析Table 3 Polymorphic analysis of single-copy nuclear gene and chloroplast gene in 320 Rosa roxburghii samples
2 結果與分析
2.1 遺傳多樣性分析
如表3所示,2段單拷貝核基因GAPDH和ncpGS拼接后的總長度為1 294 bp。其中,AT含量為58.88%～59.12%,與GC含量相差不大。共檢測到8個核苷酸變異位點,其中簡約性的信息位點5個,單一突變位點3個。變異位點分別為107、154、592、1 096、1 131、1 180、1 182和1 225。將序列提交至GeneBank,序列號為OP526995～OP527024。拼接序列檢測到15個單倍型。單拷貝核基因拼接序列的遺傳多樣性水平較低(Hd=0.449 0,π=0.000 47),但不同刺梨居群間存在較大差異(Hd=0～0.800 0,π=0～0.000 84),27個居群中,黔西南貞豐QXNZF居群(Hd=0.800 0,π=0.000 78)、畢節納雍BJNY居群(Hd=0.714 3,π=0.000 84)和畢節黔西BJQX居群(Hd=0.670 3,π=0.000 84)表現出較高的遺傳多樣性。遺傳多樣性水平最低的是云南曲靖YNQJ居群和黔東南雷山QDNLS居群(Hd、π均為0)。
對3段葉綠體基因(atpF-trnH、trnL-trnF和trnG-trnS)序列進行拼接后的總長度為1 865 bp,AT含量為71.92%～72.22%,堿基組成具有明顯的A/T偏好性,這與大多數葉綠體基因的堿基組成成分一致。其中,共檢測到20個核苷酸變異位點,簡約性的信息位點12個,單一突變位點8個。變異位點分別為55、88、142、175、209、344、415、423、430、545、556、573、590、591、656、696、967、1 227、1 592和1 740。將序列提交至GeneBank,序列號為OP526975～OP526994,OP545883～OP545922。拼接序列檢測到單倍型數量(H)20個。總體的遺傳多樣性水平不高(Hd=0.653 4,π=0.000 65),但不同刺梨居群間存在較大差異(Hd=0～0.800 0,π=0～0.001 29),在所有居群中畢節納雍BJNY居群(Hd=0.800 0,π=0.000 86)、畢節大方BJDF居群(Hd=0.736 3,π=0.000 74)和畢節七星關BJQXG居群(Hd=0.692 3,π=0.001 29)的遺傳多樣性水平較高。由此可見在西南地區中,畢節地區刺梨的遺傳多樣性較高,表明該地區野生刺梨的遺傳信息較豐富。遺傳多樣性水平最低的是湖北宜昌HBYC居群和四川涼山SCLS居群(Hd、π均為0)。
2.2 單倍型多樣性分析
基于單拷貝核基因的拼接序列,27個居群得到15個單倍型。其中,單倍型R-1分布最廣,在所有居群中均有分布,意味著單倍型R-1是主要單倍型,推測R-1為古老單倍型,其次為單倍型R-3,分布在15個群體中,為優勢單倍型。安順平壩ASPB居群和畢節黔西BJQX居群共有單倍型R-7,單倍型R-9為分布在居群畢節納雍BJNY和銅仁梵凈山TRFJS中,畢節納雍BJNY居群與黔東南黃平QDNHP居群共有單倍型R-12。單倍型R-5只分布在安順普定ASPD居群中,單倍型R-11只分布在遵義湄潭ZYMT居群中,R-13只分布于黔東南黃平QDNHP居群中,R-15六盤水盤縣LPSPX居群中。其余單倍型均分布在多個居群中(表4)。
基于葉綠體基因的拼接序列,在27個刺梨居群中得到20個單倍型,其中單倍型H-1分布最廣,在26個居群中廣泛分布,意味著單倍型H-1是群體遺傳構成的最主要單倍型,推測H-1為古老單倍型;其次是單倍型H-6,在16個居群中廣泛分布。單倍型H-4和單倍型H-5均是安順普定ASPD居群和畢節織金BJZJ居群共有;單倍型H-3只分布在安順紫云ASZY居群中,畢節七星關BJQXG擁有最多的特有單倍型(H-8、H-10、H-11和H-12,共4個特有單倍型),單倍型H-13分布在遵義湄潭ZYMT居群中,重慶酉陽CQYY居群存在特有單倍型H-14,單倍型H-15只分布在云南大理YNDL居群中,黔東南黃平QDNHP居群存在特有單倍型H-16,單倍型H-17分布在畢節金沙BJJS居群中,單倍型H-18分布在畢節大方BJDF居群中,畢節納雍BJNY居群存在2個特有單倍型H-19和H-20。其余單倍型均分布在多個居群中(表4)。
基于單拷貝核基因檢測到的15個單倍型構建單倍型網絡圖(圖2,圖3)。由圖2可知,以單倍型R-1為中心向四周發散,與單倍型R-3、R-4、R-6、R-8、R-10和R-13以一種突變步的方式直接相連,又各自發生分化,構成一個四邊形。單倍型R-10分化出R-12和R-15分別與R-3和R-8相連。單倍型R-7單獨分化出R-2。同時,網狀進化圖出現多個環狀結構,說明核基因重組事件的發生。
基于葉綠體基因所檢測到的20個單倍型進行單倍型網絡分析(圖4,圖5)。由圖4可知,20個單倍型在單倍型網絡構建圖中呈散射分布,可分為H-1和H-9兩個分支,每個分支又各自分化。一支以單倍型H-1為中心,與單倍型H-3、H-4、H-5、H-7、H-13、H-14和H-16以一種突變步的方式直接相連并聚為一類;另一支以H-9為中心,與H-2、H-6、H-8、H-10、H-11、H-12、H-14、H-15、H-18、H-19和H-20聚類在一起,包括畢節七星關BJQXG、畢節大方BJDF和畢節納雍BJNY居群的特有單倍型,表明這一支主要以畢節地區為主。特有單倍型主要位于圖的外側,說明是最晚發生突變的單倍型,并且還存在缺失單倍型,可能是未收集到或在進化過程中丟失。
圓圈大小代表頻率。下同。Circle size represents frequency. The same below.圖 2 基于刺梨單拷貝核基因構建的單倍型網絡圖Fig.2 Network diagram of Rosa roxburghii single-copy nuclear gene haplotype
表 4 27個刺梨居群基于單拷貝核基因和葉綠體基因的樣品信息、單倍型分布及多態分析Table 4 Collection information, haplotype distribution and polymorphism analysis of 27 Rosa roxburghii populations on single-copy nuclear gene and chloroplast gene
2.3 遺傳結構分析
分子方差分析(AMOVA)結果顯示(表5),基于單拷貝核基因的27個刺梨居群的遺傳變異主要發在居群內(90.51% >>9.49%),遺傳分化系數FST為0.094 87 ,基因流為2.44,遺傳距離為0～0.004,群體間遺傳分化系數為GST= 0.056
利用DnaSP 6軟件分別基于單拷貝核基因和葉綠體基因的拼接序列對320個刺梨材料進行中性檢測,結果顯示,Tajima’sD統計值分別為-1.575 16 (0.01
3 討論與結論
3.1 刺梨居群的遺傳多樣性分析
刺梨單拷貝核基因GAPDH和ncpGS聯合序列(Hd=0.469 2,π=0.000 49)以及葉綠體基因atpF-trnH、trnL-trnF和trnG-trnS聯合序列(Hd=0.653 4,π=0.000 65)的遺傳多樣性顯著低于高源等(2020)采用4段葉綠體拼接序列對蘋果屬植物的結果(Hd=0.879,π=0.009 52),劉晶(2013)對薔薇科豆梨(cpDNA:Hd =0.719,π=0.001 05)和川梨(cpDNA:Hd =0.718,π=0.000 85)的結果,同時還低于張懷山(2017)對刺梨cpDNA的研究結果(Hd=0.829,π=0.001 31),但高于其ITS序列的結果(Hd=0.247,π=0.000 40)。本研究結果表明,刺梨具有較低的遺傳多樣性。西南地區刺梨的遺傳多樣性偏低,可能與本研究所用3個cpDNA間隔區序列的進化速率有關,選用的葉綠體基因序列較為保守,需要更加精準的結果時則需要結合其他cpDNA間隔區序列(王崇等,2021);也可能是標記的基因、自身屬性以及有效群體大小不同等因素所導致。因為野生刺梨在進化過程中由少數種群產生的建立者效應或者近期發生過瓶頸效應,造成遺傳變異大量丟失,遺傳多樣性結果較低(何文等,2014)。刺梨每個居群間的單倍型多樣性(Hd)表現不同,推測可能是西南地區的地形十分復雜,使各居群所在的環境條件具有差異,經過長期不同的生態環境和自然選擇,會導致具有一定地理隔離的刺梨居群的遺傳多樣性存在差異。
3.2 刺梨居群的遺傳結構分析
種群在進化過程中,遺傳漂變、自然選擇、種群歷史和突變等因素的影響導致其遺傳結構產生復雜的構成(任婧等,2019)。通過對單拷貝核基因的研究發現,遺傳分化系數較低(FST=0.094 87),遺傳系數為NST=0.076 >GST=0.056 (P>0.05),雖然P值顯著,但是低于Petit等(2005)總結的基于核基因標記的22種植物的平均遺傳分化程度(GST=0.15)。從兩個基因的單倍型網絡圖可以看出,高頻率的單倍型分布到多數種群中,存在明顯網狀結構,但同時各單倍型在種群中交織分布,與種群的地理分布沒有明顯聯系,這也與種群間基因交流廣泛,缺乏種群特有的高頻率的單倍型有關。此外,刺梨種群的不同居群間出現了大量親緣關系靠近的單倍型,表明刺梨群體間不存在明顯的譜系地理結構。不同于葉綠體基因僅有的母系遺傳,核基因還存在花粉流,導致刺梨種群間基因交流更頻繁,基因流(Nm=2.44)較高。植物居群間遺傳結構存在較大的差異性,主要是地理上的隔離、突變、動蕩等環境因素以及基因流的隔離導致居群的遺傳分化所致(莫忠妹等,2022)。
圖 3 基于單拷貝核基因構建的單倍型地理分布圖Fig. 3 Haplotype geographical distribution map based on single-copy nuclear gene construction of Rosa roxburghii
紅點表示丟失單倍型; mv后的數字反映兩兩單倍型之間的突變步數。Red points indicate missing haplotypes; the number after mv reflects the number of mutation steps between haplotypes.圖 4 基于刺梨葉綠體基因構建的單倍型網絡圖Fig. 4 Network diagram of Rosa roxburghii chloroplast gene haplotype
表 5 刺梨種群的分子方差分析Table 5 Analysis of molecular variance in Rosa roxburghii populations
葉綠體基因的居群遺傳分化系數為GST= 0.273
圖 5 基于刺梨葉綠體基因構建的單倍型地理分布圖Fig. 5 Haplotype geographical distribution map based on chloroplast gene construction of Rosa roxburghii
圖 6 刺梨種群單拷貝核基因(左)和葉綠體基因(右)的失配分析Fig. 6 Mismatch analysis of Rosa roxburghii single-copy nuclear gene (left) and chloroplast gene (right)
通過AMOVA 分析,結果均顯示刺梨種群主要的遺傳變異發生于居群內,居群間遺傳差異較小,可能是受到奠基者效應的影響。本研究發現核基因的居群內遺傳變異(90.51%)高于葉綠體基因的居群內遺傳變異(66.35%),推測此結果可能的原因如下:(1)刺梨有自交繁育系統,而葉綠體基因僅有母系遺傳;(2)個體間花期不重疊導致居群間的花粉流有限制;(3)地理隔離和人為因素的影響,使刺梨呈現片段化分布;(4)在刺梨歷史基因流中,種子流起到最主要的作用。劉慎諤(1985)在河流流向對植物分布的影響中提到,刺梨多分布于四川、貴州,而云南僅大理有分布,推測該物種沿著金沙江古道擴散至大理,表明河流為刺梨物種分布和基因流提供地理便利或通道,而西南地區的高山阻隔在一定程度上阻礙了風媒和蟲媒等介導的花粉流,只能在有限范圍內進行基因交流。這與張懷山(2017)得到刺梨種子流大于花粉流的結果一致。本研究得出野生刺梨居群遺傳結構的主要特點是遺傳變異主要發生在居群內,居群間具有基因交流較頻繁、遺傳距離小等特點,與張懷山(2017)、魯敏等(2020)以及李楠玉等(2021)的結果一致。
中性檢驗結果表明,Tajima’sD值均為不顯著負值,符合中性進化模型。Fu’sFs值均為顯著負值,再結合兩個單倍型網絡圖與錯配分布曲線考慮,存在缺失單倍型,說明刺梨居群發生過小范圍擴張,但總體上維持穩定狀態。根據葉綠體基因和單拷貝核基因的單倍型網絡圖表示,H-1和R-1的分布范圍最廣,推測其為古老單倍型。溯祖理論認為在居群中遺傳多樣性水平最高的區域極有可能是物種的起源中心或冰期避難所(潘鳳等,2021)。我們在野外調查時發現西南地區的野生刺梨以貴州省分布最多,其他省市分布較少。在本研究中貴州省內的居群遺傳多樣性普遍較高,推測刺梨在西南地區的冰期避難所為貴州省,以貴州省為主向四周擴散,擴張時可能由于云貴高原阻斷,只能在周圍發生小距離擴張,與張懷山(2017)的結論一致。貴州省內遺傳多樣性較高的居群有畢節地區的居群,黔西南地區的居群和安順地區的居群,推測在第四紀冰期時期貴州省為主要避難所且貴州省內還存在多個避難所。
3.3 刺梨的保護策略
隨著城鎮化進程加劇以及自然環境被破壞,為避免刺梨種質資源的大規模遺失,對刺梨資源的收集和保護等方面的工作刻不容緩(魯敏等,2020)。在西南地區的27個居群中,畢節地區不僅是貴州省的主產地之一,有豐富的刺梨資源,而且遺傳多樣性水平高,還擁有多個特有單倍型,應進行優先保護,在就地保護的基礎上進行種子保存,還可采集特有單倍型居群中的少數個體以及有特殊性狀的植株,將其移至資源圃中進行保護(何文等,2014)。研究認為,對種群數量很多且遺傳多樣性水平較高的居群,特別是畢節地區、安順平壩ASPB和黔西南貞豐QXNZF等居群,應實施就地保護的策略(魯敏等,2020),對于擁有獨特單倍型的居群,如安順紫云ASZY、遵義湄潭ZYMT、畢節七星關BJQXG、畢節金沙BJJS、畢節大方BJDF、畢節納雍BJNY、重慶酉陽CQYY和黔東南黃平QDNHP居群,進行優先保護。由于刺梨主要的遺傳變異發生在居群內,而個體維持遺傳變異有著重要作用,因此在制定遷地保護策略的同時,應當盡量多保存所收集到的刺梨樣品(李楠玉等,2021)。
