UPLC-MS法測定磷酸西格列汀中的2種磷酸酯雜質的含量

朱紅茹，王廣祁,2*，王健,3，王芳，姜斌

（1.通化東寶藥業股份有限公司，吉林 通化 134123；2.沈陽藥科大學 生命科學與生物制藥學院，遼寧 沈陽 110016；3.沈陽藥科大學 制藥工程學院，遼寧 沈陽 110016；4.山東匯智藥物研究有限公司，山東 濟南 250101）

藥品在生產的過程中，由于工藝條件、環境溫度、生產設備的多種影響，往往可能產生雜質，雜質的存在對患者更是“有害無益”。其中具有潛在致癌性的雜質，又被稱為“基因毒性雜質”，由于其對患者本身的安全的重大影響，目前日益成為藥學質量研究與控制的重點。

磷酸西格列汀是一種新型的降血糖藥物，其原研為美國默沙東公司。該產品自2006年于美國上市以來，由于其療效顯著、不良反應少等諸多優點，迅速替代了原有的口服降糖藥，根據2020年默沙東公司財報顯示，該產品全球銷售額已達33.06億美元，是目前全球銷量最高的口服降糖藥。

在磷酸西格列汀原料藥生產過程中常常會用到有機溶劑甲醇及異丙醇，磷酸在加熱條件下可能與上述兩種醇發生酯化反應得到磷酸三甲酯（TMP）和磷酸三異丙基酯（TIP），而上述兩種物質均存在典型的遺傳毒性致癌性物質的警示結構[1]：烷基或苯基磷酸酯化學基團。磷酸西格列汀需患者長期服藥，且每天的推薦劑量為100 mg，因此，若TMP和TIP存在于磷酸西格列汀中，必將對產品質量及患者的身體安全造成極大的影響。

目前，國內外的藥典及科研文獻對于上述兩種基因毒性雜質均缺乏相關的報道，本研究擬開發一種全新的UPLC-MS法（超高效液相色譜法串聯質譜法），用于對磷酸西格列汀中的TMP和TIP進行檢測，對其進行了方法開發及方法學驗證。

1 儀器與材料

超高效液相色譜儀，配有自動進樣器和柱溫箱，美國Waters；QDa質譜檢測器[電噴霧離子源（ESI），美國 Waters；QUINTIX125D-1CN型電子天平，德國Sartorius；KQ600DE型超聲波清洗機，昆山舒美超聲儀器有限公司。

磷酸三甲酯（TMP），相對分子質量140.07，批號K1915060，CAS 512-56-1，純度為99.317%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸三異丙基酯（TIP），相對分子質量224.23，批號BCCB9469，CAS 513-02-0，純度為96.1%，西格瑪奧德里奇（上海）貿易有限公司；磷酸西格列汀，批號160501，通化東寶藥業股份有限公司；乙腈，色譜純，美國ASTOON；甲酸，色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司；純凈水，杭州娃哈哈股份有限公司。

2 方法與結果

2.1 儀器條件

色譜檢測條件：Waters Acquity UPLC BEH C18色譜柱，流動相A為0.01%甲酸水溶液，流動相B為乙腈，梯度洗脫見表1。流速為0.4 mL·min-1，進樣量為5 μL。

表1 梯度洗脫程序

表2 回收率試驗結果

質譜檢測條件：電噴霧離子源正離子（ESI+），錐孔電壓23 V。TMP和TIP采用SIR模式檢測，TMP質荷比為m/z=141.07，TIP質荷比為m/z=225.23，保留時間分別為2.104 min 和6.490 min。

2.2 對照品溶液的配制

精密稱取TMP和TIP對照品各適量，用乙腈溶解并稀釋制成0.15 mg·mL-1的TMP貯備液和TIP貯備液；再精密移取TMP、TIP貯備液各適量，用0.01%甲酸-乙腈（98∶2）稀釋制成0.15 μg·mL-1的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的配制

精密稱取磷酸西格列汀（批號160501）適量，用0.01%甲酸-乙腈（98∶2）溶解并稀釋至制成10 mg·mL-1的溶液，搖勻，即得供試品溶液。

2.4 專屬性

TMP系統適應性色譜圖如圖1所示，TIP系統適應性色譜圖如圖2所示。空白溶劑及樣品均對TMP和TIP檢測無干擾。

圖1 TMP系統適應性色譜圖

圖2 TIP系統適應性色譜圖

2.5 線性

本研究采用外標法，分別配制質量濃度在0.030～0.300 μg·mL-1之間的兩種磷酸酯混合標準溶液，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，按最小二乘法進行線性回歸，計算得到回歸方程。

TMP線性方程為y=8 810 489.24x-3 025.62，相關系數r為0.999；TIP線性方程為y=931 789.107 0x+509.33，相關系數r為0.997。結果表明TMP和TIP均在0.030～0.300 μg·mL-1范圍內呈現良好的線性關系。

2.6 儀器精密度

取“2.2”項下混合對照品溶液，重復進樣6針，計算結果。TMP和TIP保留時間RSD均小于1.0%，峰面積RSD值分別為2.84%、2.53%，證明采用液相質譜法進行檢測，其儀器精密度良好。

2.7 定量限及檢測限

取混合對照品溶液稀釋至相應的質量濃度，根據信噪比10∶1為定量限，信噪比3∶1為檢測限，TMP定量限為0.015 μg·mL-1，TIP定量限為0.031 μg·mL-1，均未大于限度質量濃度的五分之一；TMP檢測限為0.007 4 μg·mL-1，TIP檢測限為0.007 8 μg·mL-1，均小于限度質量濃度的十分之一，保證了樣品在微量檢測的定量與定性靈敏度。

2.8 回收率

精密稱取TMP和TIP配制成高中低3個質量濃度的回收率溶液，每個質量濃度平行配制3份，按外標法計算TMP和TIP的平均回收率及相對標準偏差（RSD），結果詳見表3。TMP的回收率為98.5%，RSD值為2.85%；TIP的回收率為95.8%，RSD值為10.07%。本方法具有良好的準確性。

表3 穩定性試驗結果

2.9 穩定性

取混合對照品溶液以及供試品溶液，分別于0、3、5、8 h進樣，計算結果詳見表3。室溫放置8 h，混合對照品溶液中TMP和TIP峰面積RSD值均小于5.0%，供試品溶液中均未檢出TMP，檢出TIP數量微小且基本保持一致，溶液在8 h內穩定。

2.10 重復性

取同一批次磷酸西格列汀（批號160501），重復配制6份供試品溶液，進樣測定，結果詳見表4。

表4 重復性試驗結果

由表4可以看出，6份供試品溶液均未檢出TMP，檢出微量TIP，含量基本一致，重復性良好。

3 討論

3.1 基因毒性雜質的限度

根據國際人用藥品注冊技術協調會（ICH）頒布的指導原則《ICH guideline M7》所述，應根據毒理學關注閾值（TTC）確定基因毒性雜質的限度[2]，本研究擬采用指導原則中所規定的最低雜質限度，即每天1.5 μg進行控制，折算出磷酸西格列汀中TMP和TIP的控制限度應為0.001 5%，此時患者一生（70歲）的致癌風險約增加十萬分之一，被認為是患癌風險的微小增加，在統計學上可被接受。

3.2 方法的制定

目前對于有機磷酸酯的雜質檢測方法有一些報道，其中包括氣相色譜法[3-4]、氣相色譜-質譜法[5-6]、以及液相色譜-質譜聯用法[7-8]。但上述方法存在響應值低、抗干擾弱[9]、運行時間較長等問題。在實際的方法開發過程中，也針對兩者的沸點（TMP沸點為197 ℃，TIP沸點為224 ℃）用氣相色譜法進行了預實驗，但此方法有雜質峰干擾、響應值較低的缺點，很難滿足微量檢測的要求。而UPLC作為新一代的色譜技術，較一般的HPLC有著運行時間短、操作簡單、綠色環保等優點，MS較之其他檢測器有著抗干擾能力強、靈敏度高等優點，將上述兩種方法串聯，作為磷酸西格列汀中測定磷酸酯雜質的方法，也為藥品中基因毒性雜質的研究提供了一個新思路。

3.3 超高效液相色譜條件的優化

通常，對于[M+H]+正離子在酸性條件下響應值可提高，本實驗采用ESI+模式[10]，分別用甲醇-0.2%甲酸水溶液、甲醇-0.01%甲酸水溶液、乙腈-0.01%甲酸水溶液作為流動相，對TMP和TIP的分離效果及檢測情況進行比較。結果表明，高濃度的甲酸對目標物的響應值并未有明顯提高，且甲醇-0.01%甲酸水溶液作為流動相時目標峰TIP的質譜響應雖更好，但受到空白溶劑峰的干擾，因此，選擇乙腈-0.01%甲酸水溶液作為流動相。

3.4 質譜條件的優化

TMP、TIP相對分子質量分別為140.07、224.23。采用Scan模式，對TMP、TIP進行m/z=50～600掃描。在線監測圖譜，初步確定TMP質荷比為158.22（加NH4+）；TIP質荷比為247.17（加Na+）；采用SIR模式，TMP在m/z=158.22無法確定出峰位置，TIP在m/z=247.17受空白溶劑干擾。

在SIR模式下，調整質荷比為m/z=141.07（加H+）、m/z=225.23（加H+），TMP、TIP保留時間分別為2.104 min和6.490 min，峰形良好且不受空白溶劑干擾。確定質荷比后在30 V錐孔電壓條件下，進行回收率考察，由于此條件下TIP響應較小，回收率RSD值偏大，調整錐孔電壓提高TIP響應值，最終確定錐孔電壓為23 V。

由UPLC色譜圖確定主峰保留時間為5.6 min，為避免主峰濃度過大污染質譜儀，采用轉化閥切斷2.5～6.2 min信號。

3.5 耐用性

當柱溫為38～42℃，流速為0.38～0.42 mL·min-1，TMP和TIP峰形均無明顯變化。磷酸西格列汀樣品中均為檢出TMP，檢出TIP含量與正常條件含量檢測結果差異不大，說明此方法耐用性良好。

4 結 論

本文建立的UPLC-MS法對磷酸西格列汀中2種磷酸酯雜質的含量檢測方法嚴格按照國內方法學驗證法規要求進行，該方法具有良好的專屬性、準確性、耐用性等，可用于磷酸西格列汀中TMP和TIP的定量分析，為磷酸西格列汀的質量研究提供了重要的研究基礎。