氮氣氣調對赤擬谷盜的防治效果及抗氧化酶活性的影響

魯玉杰, 楊 麗, 盧少華, 劉嘉澍, 胡海生, 羅文鳳, 劉亞偉

(河南工業大學糧食和物資儲備學院1,鄭州 450001)

(江蘇科技大學糧食學院2,鎮江 212100)

赤擬谷盜(TriboliumcastaneumHerbst)是一種重要的世界性分布的儲糧害蟲[1],其幼蟲和成蟲均可為害谷物及其制品,且成蟲體內的臭腺可以分泌含苯醌等致癌物質的臭液,使小麥粉等結塊、變色和發臭而喪失食用價值,造成了巨大的經濟損失[2]。目前,生產中對赤擬谷盜的防治主要依賴熏蒸劑和防護劑,長期單一性地過度使用化學藥劑不但會導致赤擬谷盜的抗藥性越來越強,而且殘留的化學藥劑也會危害人畜和環境[3,4]。隨著社會的發展,世界各國對食品安全和環境保護越來越重視,對使用化學藥劑防治儲糧害蟲的限制日益嚴格,已逐步減少化學藥劑在儲糧上的使用[5]。為了可持續地有效防治儲糧害蟲,需要尋求新的解決途徑。

氮氣氣調儲糧是指在密閉的糧堆內抽去空氣,充入氮氣,達到殺蟲的目的[6]。氮氣氣調儲糧技術不僅能防蟲、殺蟲和抑霉,而且避免了化學藥劑對人體的危害和對環境的污染,是一種安全、環保的綠色害蟲防治方法[7,8]。氧氣是需氧生物維持正常能量代謝和體內平衡所必需的,而氮氣氣調的殺蟲機理主要是低氧致死[9]。低氧脅迫會導致生物身體或身體的一部分組織缺乏足夠的氧氣而呈現一種病理狀態,進而對生物體造成不可逆的損傷[10]。低氧脅迫會破壞昆蟲脂質代謝和抑制蛋白質合成[11],增加體內活性氧(ROS)含量從而引起氧化損傷[12]。為了中和ROS過多帶來的毒性,昆蟲像其他真核生物一樣進化出了一套抗氧化酶系統來抵御氧化損傷,抗氧化酶系統可以清除體內過多的ROS,維持體內ROS代謝的平衡,減少低氧脅迫導致的氧化損傷[13,14]。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)是昆蟲體內ROS防御系統的主要抗氧化酶系。SOD可以直接催化超氧自由基轉化為H2O2和O2,而CAT和POD催化H2O2降解為H2O和O2[15],這3種抗氧化酶協調作用,共同維持昆蟲體內ROS的動態平衡狀態,保護昆蟲免受低氧等逆境環境的迫害。已有研究表明,在低氧條件下,搖蚊(Chironomusriparius)幼蟲體內的GST、CAT、SOD等抗氧化酶活性增強[16];加勒比按實蠅(Anastrephasuspensa)體內的SOD2過量表達[17];低氧再復氧后的四紋豆象(Callosobruchusmaculatus)幼蟲的耐輻射能力增強,可能是由于體內GST等抗氧化酶活性升高,消除ROS的能力增強[18]。赤擬谷盜幼蟲經缺氧再復氧后總抗氧化能力增加,SOD和CAT的活性在剛開始復氧時就不斷增加并保持在較高的水平,這些抗氧化酶是響應缺氧再復氧而誘導的,表明幼蟲增強了體內的抗氧化酶系的活性以抵御高水平的ROS[19],而條紋角石蛾(Stenopsychemarmorata)經缺氧再復氧后CAT的活性被顯著抑制[20]。

在生產實踐中,經常會發現即使在充氮低氧氣調后的糧倉中仍有殘存的赤擬谷盜繼續為害,針對這一現象,研究采用不同體積分數氮氣處理不同蟲態的赤擬谷盜,測定不同蟲態的赤擬谷盜對低氧的耐受性以及低氧脅迫下赤擬谷盜體內抗氧化酶系的活性變化,分析赤擬谷盜對低氧的耐受性及其體內抗氧化酶對低氧脅迫的響應,初步探討赤擬谷盜低氧耐受性的形成原因,為赤擬谷盜在糧倉內的氣調防治提供基礎數據,為低氧適應性的防治或者延緩低氧適應性的發展提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲

赤擬谷盜T.castaneum原種采自廣東省汕頭市,在河南工業大學儲藏物昆蟲實驗室培養數年。將全麥粉和酵母以質量比19∶1的比例混合配成飼料,用于培養赤擬谷盜。試蟲在溫度29～31 ℃、相對濕度70%～80%、無光照的恒溫恒濕培養箱中培養,分別選取幼蟲(14 d)、蛹(28 d)和成蟲(羽化后7 d)用于實驗。

1.2 主要試劑與儀器

SOD試劑盒、CAT試劑盒和POD試劑盒;電熱恒溫培養箱,RT-6100型酶標儀,TG16W型微量高速離心機,TGL16M型臺式高速冷凍離心機,HT-111B型恒溫搖床,AE1204型電子分析天平,XB220A型電子分析天平,81-2型恒溫磁力攪拌器,JY98-IIIN型細胞破碎儀。

1.3 赤擬谷盜低氧耐受性測定

低氧脅迫實驗參考Kharel等[21]的方法并稍作修改。將相同生命階段的赤擬谷盜放置在30 mL的透明玻璃瓶中,瓶中加入0.5 g飼料,瓶蓋上開有小孔以便昆蟲進行氣體交換。將玻璃瓶置于不同體積分數的氮氣(95%、97%、98%)氣調室中,氣調室由60 cm×35 cm×40 cm(長×寬×高)的透明聚碳酸酯材料制成。

實驗在25 ℃的空調房內進行。通過充入氮氣排出氣調室中的空氣,使其達到目標氮氣體積分數,氣源為鋼瓶裝高純氮。氮氣氣調的處理時間分別設置為1、3、5、7 d。不同時間的處理均分別獨立進行,即處理到目標時間后從氣調室中取出后,再重新開始另一個時間的處理,每個處理重復3次。將低氧處理后的赤擬谷盜轉移至培養箱中,觀察死亡情況,用毛筆觸碰蟲體,如果赤擬谷盜身體及附肢均不動即視作死亡,記錄死亡數據,計算校正死亡率,校正死亡率計算公式為[22]：校正死亡率=處理死亡率-對照死亡率100-對照死亡率×100%。

1.4 抗氧化酶活性測定

取經過低氧處理的50 mg赤擬谷盜幼蟲置于2 mL離心管內,加入pH為7.4的磷酸緩沖液(實驗前4 ℃預冷),2個小鋼珠,使用組織研磨儀研磨充分后,將勻漿液置于3 000 r/min離心20 min,收集上清。采用酶聯生物的昆蟲超氧化物歧化酶(SOD)酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒(產品編號ml036253)、昆蟲過氧化氫酶(CAT)酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒(產品編號ml062687)和昆蟲過氧化物酶(POD)酶聯免疫分析(ELISA)試劑盒(產品編號ml332569),酶活性測定按照試劑盒說明書進行操作。抗氧化酶活性的測定原理是應用雙抗體夾心法測定標本中昆蟲抗氧化酶水平。用純化的抗氧化酶(SOD、CAT或POD)捕獲抗體包被微孔板,制成固相抗體,往包被的微孔中依次加入昆蟲抗氧化酶,再與HRP標記的檢測抗體結合,形成抗體-抗原-酶標抗體復合物,經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色,并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的昆蟲抗氧化酶呈正相關。用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(OD值),通過標準曲線計算樣品中昆蟲抗氧化酶活性,每個處理均設3個生物學重復和4個技術重復。

1.5 數據統計分析

使用SPSS 20.0軟件進行數據統計分析。首先檢測數據方差齊性和正態性,并對校正死亡率數據進行平方根反正弦轉換。采用單因素方差分析(One Way ANOVA)評價赤擬谷盜的死亡率和抗氧化酶活性,當方差差異顯著時再用Duncan’s新復極差法對平均值進行多重比較,差異性顯著水平設置為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 不同體積分數氮氣對赤擬谷盜的致死效果

通過比較不同體積分數的氮氣處理對赤擬谷盜校正死亡率(簡稱“死亡率”)的影響,發現隨著氮氣體積分數的增大和處理時間的延長,赤擬谷盜的幼蟲、蛹和成蟲的死亡率均逐步升高。

2.1.1 不同體積分數氮氣對赤擬谷盜幼蟲的致死效果

由表1可見,采用體積分數95%和98%的氮氣處理赤擬谷盜幼蟲7 d的死亡率分別達到89.58%和98.61%,并且顯著高于同等體積分數氮氣處理1 d和3 d時的死亡率(P<0.05),而與相同體積分數氮氣處理5 d時的幼蟲死亡率差異不顯著(P>0.05);用體積分數97%的氮氣處理赤擬谷盜幼蟲7 d的死亡率達到了92.36%,并且顯著高于同等體積分數氮氣處理1 d的幼蟲死亡率(P<0.05),而與相同體積分數氮氣處理3 d和5 d時的幼蟲死亡率差異不顯著(P>0.05)。當低氧處理1 d時,隨氮氣體積分數的升高,赤擬谷盜幼蟲的死亡率顯著升高(P<0.05);低氧處理3 d時,體積分數98%的氮氣處理赤擬谷盜幼蟲的死亡率顯著高于氮氣體積分數為95%和97%的處理(P<0.05);低氧處理5 d和7 d時,體積分數98%的氮氣處理赤擬谷盜幼蟲死亡率和氮氣體積分數為95%和97%的處理差異不顯著(P>0.05)。說明使用氮氣氣調防治赤擬谷盜時,氮氣體積分數越大且處理時間越長對赤擬谷盜的防治效果越好,而且對赤擬谷盜幼蟲的防治來說,氮氣氣調的效果是以時間為主導因素的,使用氮氣氣調時延長處理時間在防治戰略上比增加氮氣體積分數效果更好。

表1 不同體積分數的氮氣處理赤擬谷盜幼蟲的校正死亡率

2.1.2 不同體積分數氮氣對赤擬谷盜蛹的致死效果

由表2可見,采用體積分數95%的氮氣處理赤擬谷盜蛹7 d的死亡率達到45.83%,并且顯著高于同等體積分數氮氣處理1、3、5 d時的蛹死亡率(P<0.05);用體積分數97%的氮氣處理赤擬谷盜蛹,隨著處理時間的延長,赤擬谷盜蛹的死亡率依次顯著升高(P<0.05),死亡率分別為71.92%(7 d)>53.86%(5 d)>46.95%(3 d)>43.86%(1 d);用體積分數98%的氮氣處理1 d后,赤擬谷盜蛹的死亡率已達到52.75%,而處理7 d時的死亡率則高達80.19%,且顯著高于處理1、3、5 d蛹的死亡率(P<0.05)。說明在適當的低氧條件下,隨著處理時間的延長,赤擬谷盜蛹的死亡率逐漸升高。而在相同的低氧處理時間內,隨著氮氣體積分數的增大,赤擬谷盜蛹的死亡率依次顯著升高(P<0.05)。說明與處理時間相比,氮氣體積分數對赤擬谷盜蛹的死亡率的影響更大。

表2 不同體積分數的氮氣處理赤擬谷盜蛹的校正死亡率

2.1.3 不同體積分數氮氣對赤擬谷盜成蟲的致死效果

由表3可見,采用體積分數95%、97%、98%的氮氣處理7 d的赤擬谷盜成蟲的死亡率分別為13.19%、21.68%、30.55%,均顯著高于相同體積分數氮氣處理1、3、5 d時的成蟲死亡率(P<0.05)。說明相同體積分數的氮氣處理條件下,隨著處理時間的延長,赤擬谷盜成蟲死亡率逐漸上升。低氧處理1 d時,體積分數98%的氮氣處理赤擬谷盜成蟲的死亡率為8.36%,顯著高于體積分數95%和97%的氮氣處理赤擬谷盜成蟲的死亡率(P<0.05),而體積分數95%和97%氮氣對赤擬谷盜成蟲的殺死效果差異不顯著(P>0.05);與體積分數95%的氮氣相比,體積分數98%的氮氣處理3 d的赤擬谷盜成蟲的死亡率顯著升高(P<0.05),而與體積分數97%的氮氣的赤擬谷盜成蟲的死亡率差異不顯著(P>0.05);與體積分數95%和97%的氮氣相比,體積分數98%的氮氣處理5 d和7 d的赤擬谷盜成蟲死亡率顯著升高(P<0.05)。說明相同處理時間內,隨著氮氣體積分數的增大,赤擬谷盜成蟲的死亡率逐漸上升。在體積分數95%、97%、98%的氮氣條件下,低氧會對昆蟲產生亞致死效應,而隨著低氧處理時間的延長,赤擬谷盜成蟲的死亡率會逐漸升高,Kharel等[21]的研究也證明了這個觀點[21]。

表3 不同體積分數的氮氣處理赤擬谷盜成蟲的校正死亡率

低氧氣調防治儲糧害蟲的效果與氣體體積分數、昆蟲物種、發育階段、蟲齡和低氧脅迫時間有關[6,23]。通過比較不同體積分數的氮氣對赤擬谷盜幼蟲、蛹和成蟲處理不同時間的死亡率發現,赤擬谷盜的不同蟲態對低氧的耐受性順序為成蟲>蛹>幼蟲,氮氣體積分數越大,處理時間越長,赤擬谷盜的死亡率越高。有研究表明,赤擬谷盜成蟲對低氧耐受性最高,可能與成蟲具有調節氧通量和水分平衡的有效系統有關,其提高了成蟲對低氧的耐受性[24]。而赤擬谷盜的蛹較幼蟲的死亡率低,這可能是因為赤擬谷盜蛹期的呼吸代謝速率比較低[6]。盡管低氧處理對蛹的殺死效果較弱,但低氧處理能夠延遲赤擬谷盜蛹的羽化時間,這能夠有效地延緩害蟲種群的增長,從而有助于在密閉環境中更有效地控制害蟲的數量[21,25]。李雙宇等[26]研究赤擬谷盜對低氧的耐受性時發現,赤擬谷盜對低氧的耐受性順序為:蛹>幼蟲>成蟲,而韓欣等[27]發現,不同氧氣條件下不同蟲態對氧氣耐受性順序有所差異,在體積分數4%氧氣環境下,耐受性順序為:蛹>成蟲>老熟幼蟲>中齡幼蟲>低齡幼蟲。與本研究結果的差異可能與選用的赤擬谷盜的品系、氮氣體積分數、低氧處理時間以及溫濕度有關。

2.2 不同體積分數氮氣對赤擬谷盜幼蟲體內抗氧化酶活性的影響

2.2.1 不同體積分數氮氣對赤擬谷盜幼蟲體內超氧化物歧化酶活性的影響

由表4可見,體積分數98%的氮氣處理5 d時間內,赤擬谷盜幼蟲體內SOD酶的活性先上升后下降;體積分數95%的氮氣處理5 d時間內,赤擬谷盜幼蟲體內SOD酶的活性逐漸上升。說明赤擬谷盜幼蟲體內SOD酶對不同條件的低氧處理的響應程度不同,對高體積分數氮氣的響應速度更快,說明高體積分數氮氣對赤擬谷盜幼蟲的脅迫作用更強,殺蟲更快[28],SOD酶活性的升高可以降低有毒產物對昆蟲的影響,從而增強昆蟲對氮氣的耐受性[29]。

表4 不同體積分數氮氣對赤擬谷盜幼蟲體內超氧化物歧化酶活性的影響

在體積分數95%的氮氣條件下,隨著處理時間的延長,赤擬谷盜幼蟲體內SOD酶的活性逐漸升高,分別為1 391.03 U/g(5 d)>1 293.31 U/g(3 d)>858.87 U/g(1 d)(P<0.05)。與處理1 d和5 d時相比,體積分數98%的氮氣處理3 d時的赤擬谷盜幼蟲體內SOD酶的活性最高(P<0.05),達到了1 489.32 U/g。低氧處理1 d和3 d時,體積分數98%的氮氣較95%的氮氣對赤擬谷盜幼蟲體內SOD酶的活性與對照組相比升高程度更顯著(P<0.05),分別升高了238%和313%;而低氧處理5 d時,體積分數95%的氮氣較98%的氮氣對赤擬谷盜幼蟲體內SOD酶的活性升高程度更顯著(P<0.05),升高了288%。

2.2.2 不同體積分數氮氣對赤擬谷盜幼蟲體內過氧化氫酶活性的影響

由表5可見在體積分數95%的氮氣條件下,隨著處理時間的延長,赤擬谷盜幼蟲體內CAT酶的活性逐漸升高,分別為566.86 U/g(5 d)>345.49 U/g(3 d)>318.60 U/g(1 d)(P<0.05)。在體積分數98%的氮氣條件下,隨著處理時間的延長,赤擬谷盜幼蟲體內CAT酶的活性逐漸下降,分別為700.01 U/g(1 d)>627.63 U/g(3 d)>484.04 U/g(5 d)(P<0.05)。

表5 不同體積分數氮氣對赤擬谷盜幼蟲體內過氧化氫酶活性的影響

表6 不同體積分數氮氣對赤擬谷盜幼蟲體內過氧化物酶活性的影響

低氧處理1 d和3 d時,體積分數98%的氮氣較95%的氮氣對赤擬谷盜幼蟲有顯著高的CAT酶活性(P<0.05),與對照組相比分別升高了200%和181%;而低氧處理5 d時,體積分數95%的氮氣較98%的氮氣對赤擬谷盜幼蟲有顯著高的CAT酶活性(P<0.05),升高了162%。

隨著低氧處理時間的延長,體積分數95%的氮氣處理赤擬谷盜幼蟲體內CAT酶的活性逐漸升高,而體積分數98%的氮氣處理赤擬谷盜幼蟲體內CAT酶的活性逐漸降低,這可能與赤擬谷盜幼蟲的CAT酶對不同體積分數氮氣脅迫的響應程度不同,CAT酶響應體積分數98%的氮氣處理較體積分數95%的氮氣處理的速度更快。

2.2.3 不同體積分數氮氣對赤擬谷盜幼蟲體內過氧化物酶活性的影響

在體積分數95%的氮氣條件下,隨著處理時間的延長,赤擬谷盜幼蟲體內POD酶的活性先降低后升高,分別為2 411.90 U/g(1 d)>2 201.61 U/g(5 d)>2 194.79 U/g(3 d) (P<0.05)。在體積分數98%的氮氣條件下,隨著處理時間的延長,赤擬谷盜幼蟲體內POD酶的活性逐漸降低,分別為3 401.35 U/g(1 d)>2 950.13 U/g(3 d)>2 411.25 U/g(5 d)(P<0.05)。但在相同的處理時間內,體積分數98%的氮氣較體積分數95%的氮氣有顯著高的POD酶活性,與對照組相比分別升高了185%、160%、132%。說明赤擬谷盜幼蟲體內的POD酶能夠較快地對低氧處理做出響應,并且對高體積分數氮氣做出的響應更快更強。

抗氧化酶活性的顯著增加是氧化應激的標志,也體現了昆蟲較強的抗氧化應激能力[30]。通過比較赤擬谷盜幼蟲的3種抗氧化酶對不同體積分數氮氣處理的響應,發現POD酶對低氧的響應速度最快、強度最強;CAT酶對高體積分數氮氣的響應速度較快,對較低體積分數氮氣的響應速度較慢;而SOD酶對低氧的響應速度較POD酶和CAT酶均要慢。因此,推測POD酶和CAT酶在赤擬谷盜幼蟲短時間或瞬時的低氧脅迫中發揮作用,而SOD酶在赤擬谷盜幼蟲應對相對較長時間的低氧脅迫或適應中發揮作用。有研究表明,經過4 mg O2/L的低氧脅迫的條紋角石蛾幼蟲體內SOD酶的活性顯著升高,然而更嚴重的2 mg O2/L的低氧脅迫后體內的SOD酶的活性與對照組的差異不顯著,CAT酶在2 mg O2/L的低氧脅迫下的活性比在4 mg O2/L的低,且均低于對照組的活性,表明CAT酶和SOD酶對低氧脅迫有不同的響應模式[20]。

3 結論

隨著氮氣體積分數的增大和低氧處理時間的延長,赤擬谷盜幼蟲、蛹和成蟲的死亡率均逐步升高,赤擬谷盜不同蟲態對低氧的耐受性由強到弱的順序為成蟲>蛹>幼蟲。在條件允許的情況下,盡可能降低氧氣體積分數,較低的氧氣體積分數能夠有效殺死赤擬谷盜或延遲蛹和幼蟲的發育,以達到控制害蟲種群的目的。低氧處理能夠激活赤擬谷盜體內抗氧化酶的響應,其中POD酶對低氧的響應速度最快、強度最強;CAT酶對高體積分數氮氣的響應速度較快,對較低體積分數氮氣的響應速度較慢;而SOD酶對低氧的響應速度較POD酶和CAT酶均要慢。POD酶和CAT酶可能在赤擬谷盜應對短時間或瞬時的低氧脅迫中發揮作用,而SOD酶可能在赤擬谷盜應對相對較長時間的低氧脅迫或適應中發揮作用。