基于超高效液相色譜-三重四極桿質譜技術的冬瓜瓤化學成分分析

陸勝勇,傅曼琴,徐玉娟,謝大森,余元善,溫靖,肖更生*

1(廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所/農業農村部功能食品重點實驗室/廣東省農產品加工重點實驗室,廣東 廣州,510610)2(仲愷農業工程學院 輕工食品學院,廣東 廣州,510225)3(廣東省農業科學院蔬菜研究所/廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室,廣東 廣州,510640)

冬瓜[Benincasahispida(Thb.) Cogn.]是葫蘆科草本植物,我國南北地區均有種植,且種植面積大,產量高,是僅次于黃瓜的第二大瓜類蔬菜[1]。冬瓜富含營養成分,含有多種功能活性成分,低鈉高鉀,且具有較高的藥用價值,能清熱利水、減肥降脂、防治心腦血管疾病等,有一定的保健或治療效果[2-3]。冬瓜藥食價值高,但其物質基礎研究較少,功效成分未有明確的解釋。因此,冬瓜的化學成分分析對其藥食價值說明和精深加工指導具有重要的科學意義。張曉蕾等[4]利用GC-MS對冬瓜皮和果肉測定鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯[bis(2-ethylhexyl) phthalate,DEHP]發現,DEHP含量果皮顯著高于果肉;盛留洋等[5]對生腌冬瓜和熟腌冬瓜的研究發現,兩者的揮發性物質有顯著性差異;李楊等[6]在冬瓜皮不同干燥工藝研究中發現,烘箱60 ℃、烘箱105 ℃、常溫30 ℃和微波干燥中,活性成分保留效果最好的干燥工藝為烘箱60 ℃干燥。冬瓜貯運性好,有較長的貨架期,具有良好的加工性能,是現代農產品加工的良好原料和調節市場供需關系的的重要蔬菜[7]。冬瓜傳統的加工產品以餡料、蜜餞以及果脯為主,此外,常見的還有冬瓜醬、冬瓜果凍、冬瓜保健飲料等[8],往往只利用冬瓜果肉,產生8%的冬瓜皮和4%的冬瓜瓤被作為廢棄物直接丟棄[9-10]。

冬瓜瓤作為一種副產物,潛在的經濟價值高,現有的研究中,冬瓜瓤可以加工成飲料及其發酵酒[11],除此,并沒有更多的研究或產品開拓冬瓜瓤市場。目前,冬瓜瓤的化學成分分析鮮有報道,制約著冬瓜瓤精深加工利用,對提高冬瓜的經濟附加值有一定的局限。因此,本研究首次運用廣泛靶向代謝組學技術對冬瓜瓤代謝物進行分離鑒定,分析其化學成分,為冬瓜副產物精深加工及品質調控提供參考依據,對于延長冬瓜產業鏈,促進冬瓜產業高質量發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑皮冬瓜,廣東省農業科學院蔬菜研究所。

甲醇、乙腈(色譜純),Merck &Co.Inc.;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO,色譜純),BioBioPha/Sigma-Aldrich;三吡啶三吖嗪(tripyridine triazine,TPTZ)、DPPH(98%)、Trolox(分析標準品),上海源葉生物科技有限公司;乙酸鈉等試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

101-3ABS鼓風干燥箱,上海科恒實業發展有限公司;Scientz-100F冷凍干燥機,寧波新芝生物科技股份有限公司;MM 400研磨儀,德國Retsch公司;Nexera X2超高效液相色譜(ultra performance liquid chromatography, UPLC),日本SHIMADZU公司;4500 QTRAP串聯質譜(tandem mass spectrometry, MS/MS),德國Applied Biosystems公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 冬瓜不同部位的總黃酮、總酚及抗氧化測定

將冬瓜皮、肉、瓤和籽進行干燥、研磨,參考王立抗等[12]測定冬瓜瓤總黃酮、總酚,其中總黃酮結果以每克冬瓜皮、肉、瓤、籽中所含蘆丁當量(rutinum equivalent,RE,mg RE/g)表示,總酚結果以每克冬瓜皮、肉、瓤、籽中所含沒食子酸當量(gallic acid equivalent,GAE,mg GAE/g)表示;取冬瓜4個部位的總酚提取液測定其鐵離子還原力、DPPH自由基清除力和ABTS陽離子自由基清除力,其中結果以每克冬瓜皮、肉、瓤、籽中所含Trolox當量(mg TE/g)表示。

鐵離子還原力:FRAP-Trolox抗氧化活性測定,參考DINARDO等[13]的方法,取1 mL樣液加入3 mL FRAP工作液[0.3 mol/L乙酸鈉水溶液∶10 mmol/L TPTZ鹽酸(40 mmol/L)溶液∶20 mmol/L FeCl3水溶液=10∶1∶1, 體積比],室溫避光反應10 min,593 nm測定吸光值,每個樣品測定3次,以Trolox為對照品;

DPPH自由基清除力:DPPH-Trolox抗氧化活性測定參考SHARMA等[14]的方法,取1 mL樣液加入5 mL DPPH-乙醇溶液(130 μmol/L)室溫避光反應30 min,517 nm測定吸光值,每個樣品重復3次,Trolox為對照品。

ABTS陽離子自由基清除力:ABTS-Trolox抗氧化活性測定,參考MZID等[15]的方法,配制7 mmol/L ABTS陽離子儲備液,使用時無水乙醇稀釋使其吸光值為0.70±0.02。0.5 mL樣液,加入3 mL ABTS陽離子稀釋液,室溫避光反應30 min,734 nm測定吸光值,每個樣品重復3次,Trolox為對照品。

1.3.2 冬瓜瓤UPLC-MS/MS樣品制備

參考CHEN等[16]的方法,將冬瓜瓤進行真空冷凍干燥,研磨至粉末狀。準確稱取0.100 0 g粉末,1.2 mL提取液(70%甲醇)溶解,渦旋6次(間隔30 min/次,每次渦旋30 s),得到的樣液放置于4 ℃過液,離心10 min(12 000 r/min),將上清液過微孔濾膜(孔徑0.22 μm),保存濾液于進樣瓶用于UPLC-MS/MS分析。

1.3.3 UPLC-MS/MS采集分析

1.3.3.1 UPLC條件

色譜柱:Agilent SB-C18 1.8 μm,2.1 mm×100 mm;流動相程序:流速0.35 mL/min;柱溫40 ℃;進樣量4 μL。

UPLC流動相洗脫方法:A相為超純水-0.1%(體積分數,下同)的甲酸,B相乙腈-0.1%的甲酸,0～9 min,95%～5% A、5%～95% B,9～10 min,5% A、95% B,10～11 min,5%～95% A、95%～5% B,11～25 min,95% A、5% B。

1.3.3.2 MS/MS條件

由三重四極桿線性離子阱質譜儀(Q TRAP),AB4500 Q TRAP UPLC/MS/MS系統(配備了ESI Turbo離子噴霧接口),由Analyst 1.6.3軟件(AB Sciex)控制運行正負2種離子模式。ESI源操作參數參考ZHOU等[17]的方法,離子源氣體Ⅰ,氣體Ⅱ和簾氣分別設置為50、60、25.0 psi,參數設置為高。

1.4 數據統計與分析

采用Excel、Origin 2018對1.3.1節數據進行統計分析及作圖,運用SPSS對結果進行顯著性差異分析。基于武漢邁維生物公司自建數據庫與代謝物信息公共數據庫,根據二級譜信息和三重四極桿質譜的多反應檢測模式(multiple reaction monitoring, MRM)進行代謝物定性定量。利用軟件Analyst 1.6.3處理質譜數據,利用Origin 2018等軟件進行作圖分析。

2 結果與分析

2.1 冬瓜各部位總黃酮、總酚及抗氧化活性分析

黃酮、多酚類化合物在植物的抗氧化活性中起重要作用[18]。由圖1可知,冬瓜中不同部位黃酮含量存在顯著性差異,其中冬瓜肉總黃酮含量最高,為2.45 mg RT/g,瓤中次之,為1.90 mg RT/g,冬瓜籽含量最低。冬瓜各部位總多酚含量介于0.31～2.36 mg GAE/g,4個部位的總多酚含量存在顯著性差異,冬瓜瓤含量最高,為2.36 mg GAE/g,冬瓜肉次之,為1.73 mg GAE/g,冬瓜籽含量最低。

a-冬瓜各部位總黃酮和總酚;b-DPPH自由基清除能力;c-ABTS陽離子自由基清除能力;d-鐵離子還原力

基于冬瓜各部位多酚提取物,測定其還原力、DPPH自由基清除力、ABTS陽離子自由基清除力,結果表明,不同部位提取物均有不同程度的還原力和自由基清除力,其中冬瓜瓤部位的還原力(2.38 mg TE/g)、DPPH自由基清除能力(1.60 mg TE/g)和ABTS陽離子自由基清除能力(68.11 mg TE/g)均是最強,冬瓜肉次之,冬瓜籽最弱。因此,相較于冬瓜皮、肉和籽,冬瓜瓤的抗氧化能力最強。因此,本研究選取冬瓜瓤為研究對象,基于UHPLC-QqQ-MS分析其化學成分。

2.2 廣泛靶向代謝組樣本質控及統計分析

通過對質控(quality control,QC)樣本質譜檢測分析的MRM代謝物檢測多峰圖(多物質提取的離子流譜圖)進行重疊展示分析,可以看到重復樣本不同物質的離子峰值重疊性比較好(圖2-a),質控樣本的總離子流圖如圖2-b所示,QC樣品總離子流圖的基線穩定,其重復性好,峰分離度高。說明實驗過程具有穩定性,檢測結果可靠。

a-MRM代謝物檢測多峰圖;b-QC樣本總離子流圖

2.3 冬瓜瓤代謝物組成分析

2.3.1 代謝物分類

通過冬瓜瓤代謝組學數據,共鑒定出825種代謝物,圖3根據代謝物的結構對冬瓜瓤的代謝物進行一級分類,分為11類。其中初生代謝物451個(59.01%),包括氨基酸及其衍生物(114個,21.41%)、脂質(123個,13.28%)、有機酸(74個,10.82%)、糖及醇類(58個,6.68%)、核苷酸及其衍生物(62個,5.62%)、維生素(20個,1.22%);次生代謝物374個(40.99%),包括酚酸類(161個,21.10%)、生物堿(57個,7.84%)、黃酮(92個,7.36%)、木脂素和香豆素(51個,3.63%)、萜類(13個,1.06%)。

a-初生代謝物;b-次生代謝物

2.3.2 初生代謝物分析

為了研究冬瓜瓤中的重要化合物及主要特性,表1篩選冬瓜瓤中相對含量≥0.5%的初生代謝物,共計27種,是總代謝物的35.88%,包括氨基酸及其衍生物(8種,15.86%)、脂質(8種,8.28%)、有機酸(5種,6.19%)、核苷酸及其衍生物(4種,3.72%)、糖及醇類(2種,1.84%)。

2.3.2.1 氨基酸及其衍生物

氨基酸是蛋白質的基本組成單位,冬瓜瓤氨基酸及其衍生物種類及含量豐富,共檢測出114種氨基酸及其衍生物,由表1可知,相對含量≥0.5%的氨基酸及其衍生物有L-谷氨酸、L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-天門冬氨酸鈣、反-4-羥基-L-脯氨酸、L-酪氨酸、L-色氨酸、3-氨基丙酸甲酯鹽酸鹽。其中L-色氨酸(0.96%)是8種必需氨基酸之一,其在癩皮病、精神分裂癥、抑郁癥、高血壓及疼痛等方面有良好的療效[19-20];L-谷氨酸(3.91%)是最主要呈鮮味氨基酸之一,還包括天冬氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸及其鈉鹽,此外,含量較多的L-精氨酸、組氨酸也有重要的生理作用和營養功能[21]。

2.3.2.2 核苷酸及其衍生物

核苷酸是組成DNA和RNA的基本單位,是生物體內重要的低分子化合物,核苷酸參與多種調節和代謝,通過參與細胞代謝和更新,改善細胞活力,提高機體自身功能和自我調節能力,也可改善食物的感官特征[22]。本研究從冬瓜瓤中檢測到62種核苷酸及其衍生物,由表1可知,其相對含量≥0.5%的核苷酸及其衍生物有2′-脫氧肌苷-5′-單磷酸、鳥苷、腺苷、阿糖腺苷。

2.3.2.3 糖及醇類

糖是生物體所需要的必須營養物質,參與生物體的合成與代謝,冬瓜瓤中共鑒定出58種糖及醇類,包括24種糖、14種醇、15種糖酸以及5種糖醇衍生物。冬瓜瓤中相對含量≥0.5%的糖及醇類代謝物有D-木糖酸、葡萄糖酸,此外,還積累了果糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖。

2.3.2.4 有機酸

有機酸和糖的比例影響著果實的風味品質,冬瓜瓤中有機酸的種類和含量豐富,共檢測出74種有機酸,其中相對含量≥0.5%的有機酸有2,3-二羥基-3-甲基丁酸、琥珀酸、丙醇二酸、4-胍基丁酸、檸檬酸(表1)。其中琥珀酸(1.28%),可賦予食物鮮味;丙醇二酸(1.15%)是具有較強功能活性的有機酸,丙醇二酸能有效抑制糖類轉化為脂肪,減少脂肪堆積,在減肥方面有較好的效果[23],此外,還能防治高血壓和動脈粥樣硬化,是衡量原料及其加工品保健功能的重要指標之一[24]。

2.3.2.5 脂質

脂質廣泛存在生物體中,是生物體所需的重要營養素之一,也是細胞重要的組成成分。冬瓜瓤中共鑒定出123種脂類物質,主要為溶血磷脂(53種,30.69%)和脂肪酸(60種,68.42%),還包括甘油酯(8種,0.77%)、鞘脂(2種,0.11%);相對含量≥0.5%的脂類物質有亞油酸、棕櫚醛、肉豆蔻酸、巖芹酸、11-十八碳烯酸、溶血磷脂酰膽堿 18∶1、溶血磷脂酰膽堿 18∶1(2n異構)、十八碳-9E,13E,15Z-三烯酸(表1)。冬瓜瓤中含量最高亞油酸(1.97%),是功能性多不飽和脂肪酸,是人體的必需脂肪酸,適量的亞油酸,能降低膽固醇[25]。另外含量較高的肉豆蔻酸(1.21%)可減少皮膚炎癥和傷害感受,還具有抗氧化和抗糖尿病作用,可應用于食品調味劑[26]。

2.3.3 次生代謝物分析

表2篩選冬瓜瓤中相對含量≥0.5%的次生代謝物,共22種,占總代謝物的28.26%,包括酚酸類(9種,15.66%)、黃酮(4種,5.95%)、生物堿(6種,5.67%)、木質素和香豆素(2種,1.70%)、萜類(1種,0.65%)。

表2 冬瓜瓤主要的次生代謝物

2.3.3.1 黃酮

冬瓜瓤中的黃酮種類和含量非常豐富,共檢測出92種黃酮類代謝物,主要是黃酮、二氫黃酮、黃酮醇,還包括查爾酮、二氫黃酮醇、花青素、黃酮碳糖苷、異黃酮共10個亞類,具有顯著的抗氧化、抗炎癥、提高免疫力、降低心血管疾病風險的生物學活性[27]。相對含量≥0.5%的黃酮類代謝物有苜蓿素-7-O-葡萄糖二酸苷(2.07%)、4′-羥基-5,7-二甲氧基黃酮(2.41%)、川陳皮素(0.90%)、桔皮素(0.57%),4′-羥基-5,7-二甲氧基黃酮、川陳皮素、桔皮素是多甲氧基黃酮化合物,現有研究中,它們具有體內體外化學預防作用,包括抗癌、抗炎、抗動脈粥樣硬化和神經保護,通過調節信號級聯、基因轉錄以及蛋白質功能和酶活性來調節細胞生理功能[28]。

2.3.3.2 生物堿

生物堿是一類含氮的有機化合物,具有顯著的生物活性,冬瓜瓤共檢測出57種生物堿代謝物,分屬于吡啶類(5種)、吡咯類(3種)、酚胺類(14種)、生物堿類(26種)、吲哚類(9種)。相對含量≥0.5%的生物堿有左旋肉堿(2.21%)、膽堿(1.00%)、葫蘆巴堿(0.73%)、組氨醇(0.60%)、乙酰左旋肉堿鹽酸鹽(0.58%)和煙胺(0.55%),其中含量最多的是左旋肉堿,是廣泛存在于生物體內的活性物質,是通過刺激脂肪分解和β氧化來調節脂質代謝,并伴有相應的基因表達變化和抑制脂肪原基因表達,具有抗肥胖作用[29];含量較多的膽堿是構成生物膜的重要組成成分,是人類必須的營養素,可以促進腦發育和提高記憶力、促進脂肪代謝和體內轉甲基代謝,還可以降低血清膽固醇,預防心血管疾病[30-31];此外,葫蘆巴堿(0.73%)能促進人體新陳代謝,具有降血糖[32]、降血脂[33]和抗腫瘤的活性作用[34]。

2.3.3.3 酚酸類

酚酸是廣泛分布在植物中的一類生物活性物質,賦予植物顏色、風味等,具有抗炎、抗血栓、抗糖尿病等藥理特性[35]。冬瓜瓤酚酸的種類和含量豐富,共鑒定出161中酚酸類代謝物,相對含量≥0.5%的酚酸類代謝物有3,4,5-三甲氧基苯基-1-O-葡萄糖苷、脫氫二松柏醇-γ′-O-葡萄糖苷、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、原兒茶酸-4-O-葡萄糖苷、香草醛、1-O-龍膽酰-D-葡萄糖、芐基-(2″-O-木糖基)葡萄糖苷,其中含有0.76%的香草醛,是一種重要的調味化合物,具有香莢蘭豆香氣及濃郁的奶香,起增香和定香作用,廣泛應用在食品和飲料的添加劑以及各種藥物配方的掩蔽劑等[36]。

2.3.3.4 木脂素和香豆素

木脂素和香豆素廣泛分布在植物和人類食物來源中,有多種藥理特性,如抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化和抗肝臟損傷等[37-38]。冬瓜瓤中共檢測出51種木脂素和香豆素代謝物,其中木脂素27種,香豆素24種。相對含量≥0.5%的木脂素代謝物有松脂醇-4-O-葡萄糖苷、松脂醇-4,4′-O-二-O-葡萄糖苷。東莨菪內酯是冬瓜瓤中相對含量較高的代謝物,占冬瓜瓤代謝物的0.22%,是一種具有多種藥理作用的活性物質,如抗腫瘤、降血壓和降血糖等[39]。

3 結論

比較冬瓜皮、肉、瓤和籽4個部位,冬瓜瓤總黃酮含量僅次于冬瓜肉,且總酚含量最高;此外冬瓜瓤總酚提取液的鐵離子還原力(2.38 mg TE/g)、DPPH自由基清除力(1.60 mg TE/g)和ABTS陽離子自由基清除力(68.11 mg TE/g)均是最強,因此冬瓜瓤的抗氧化能力最強。本研究首次采用廣泛靶向代謝組學方法,分離鑒定冬瓜瓤的代謝物,檢測出825種代謝物,其中,初生代謝物451種(59.01%),次生代謝物374種(40.99%)。氨基酸、核苷酸、脂質、有機酸,糖及醇類代謝物為冬瓜瓤主要的初生代謝物,黃酮、酚酸類、生物堿類代謝物為冬瓜瓤中主要的次生代謝物。

本研究通過分析冬瓜瓤各類代謝物數量和豐度,揭示冬瓜瓤中代謝物對冬瓜副產物營養和活性的貢獻。本研究結果為冬瓜瓤副產物精深加工和利用提供了理論依據。