豇豆泡菜中產生物胺菌株的篩選鑒定及其產胺特性研究

黃巖,鮮雙,李倩,陳其青,徐飛,陳安均*

1(四川農業大學 食品學院,四川 雅安,625014)2(四川李記醬菜調味品有限公司,四川 眉山,620030)

生物胺是一類廣泛存在于發酵食品中的呈堿性的低分子有機含氮有機化合物,人體過量攝入會引發各種不良反應,其中組胺的毒性最強[1]。游離氨基酸的脫羧作用是食品中生物胺的主要生成途徑,包括三大要素:存在游離氨基酸;存在能產生相應游離氨基酸脫羧酶的微生物;適宜微生物生長繁殖及發揮酶活性的環境條件[2]。相關研究發現,食品中常見的產胺微生物包括:腸桿菌科、假單胞菌屬、乳酸菌、酵母菌等[3-4]。張黎明等[5]從腌魚中篩選到25株產生物胺菌株,分屬于腸桿菌屬、不動桿菌屬、產氣單胞菌屬、摩根氏菌屬、肥桿菌屬、希瓦氏菌屬、普羅威登斯菌屬和嗜鹽單胞菌屬8個種屬。泡菜作為我國代表性的傳統發酵制品之一,在其制作過程中,往往會由于部分微生物的作用而產生生物胺。唐垚等[6]從四川泡菜中篩選出11株產生物胺的細菌,包括解鳥氨酸拉烏爾菌、弗氏檸檬酸桿菌、特基拉芽孢桿菌和阿耶波多氏芽孢桿菌。食品中產胺微生物的種類及數量與生物胺含量密切相關,明確泡菜中產胺微生物種類,通過控制其生長及產酶活性,對泡菜中生物胺的防控意義重大。

環境因子(pH、鹽度、溫度等)對食品中的微生物生長以及各種酶活都有明顯的影響[7]。喬娜[8]研究發現通過添加乳酸顯著降低pH值進而抑制鯉魚冷藏過程中生物胺的形成,延長魚的貨架期。XIE等[9]研究了不同鹽濃度的大豆醬在自然發酵過程中生物胺的變化,發現生物胺含量與鹽度呈負相關。趙慶志等[10]研究了鮐魚在不同貯藏溫度下生物胺變化情況,發現低溫可以有效地控制生物胺的積累。

基于以上研究,本研究以傳統豇豆泡菜為對象,對產生物胺菌株進行分離篩選及鑒定,探究菌株在不同生長環境條件下的產胺特性,進而控制生物胺的形成,提高泡菜的食用安全性,為泡菜發酵過程中生物胺的防控提供一定理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗原料

新鮮豇豆及香辛料,雅安市雨城區蒼坪路農貿市場;泡菜鹵水,實驗室自制多輪循環使用的老壇。

1.1.2 主要試劑

NaCl、NaOH、NaHCO3、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、FeSO4·7H2O、CaCO3、鹽酸、氨水、葡萄糖、溴甲酚紫、吐溫-80、乙腈(色譜級)、甲醇(色譜級),成都科隆化學品有限公司;氨基酸(色氨酸、組氨酸、酪氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸),上海生工生物工程股份有限公司;生物胺(色胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺),美國西格瑪試劑公司;色譜級丹磺酰氯,上海麥克林生化科技有限公司;5′-磷酸吡哆醛,上海凜恩科技發展有限公司。

1.1.3 培養基

胰蛋白胨、酵母浸粉、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養基(violet red bile agar,VRBA)、MRS培養基、酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養基(yeast extract peptone dextrose medium,YPD)、LB肉湯培養基、MRS肉湯培養基、YPD肉湯培養基,青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

PHS-3C雷磁pH計,上海儀電科學儀器股份有限公司;HC-2062高速離心機,安徽中科中佳科學儀器有限公司;DNP-9162電熱恒溫培養箱,上海精宏實驗設備有限公司;電熱恒溫水浴鍋,北京市永光明醫療儀器有限公司;DSX-30L手提式高壓蒸汽滅菌器,上海申安醫療器械廠;HR40-IIA2生物安全柜,青島海爾特種電器有限公司;Ultimate 3000高效液相色譜儀,賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 泡菜制作方法

將洗凈后的新鮮豇豆晾干至表面無水氣,將純凈水煮沸后添加食鹽(60 g/L)和白糖(20 g/L)攪拌至完全溶解,冷卻至常溫。香辛料添加量以豇豆質量為基準,紅辣椒20 g/kg、生姜10 g/kg、大蒜10 g/kg、花椒2 g/kg。稱取500 g豇豆,按照料液質量比1∶4裝壇,最后加入體積分數1%的白酒,鹽水水封后進行發酵。

1.3.2 微生物分離純化

分別從不同發酵時期無菌操作均勻吸取25 mL泡菜發酵液,轉移至225 mL無菌生理鹽水中,制得10倍稀釋液,振蕩均勻,依次梯度稀釋得到10-7樣品稀釋液,選取適宜梯度的樣液,分別涂布于VRBA、MRS、YPD平板上,在28 ℃或37 ℃培養48 h后,根據菌落形態特征差異,每個平板隨機挑選3～7個單菌落進行分離純化,連續平板劃線2～3次,確保得到純的單菌落。對單個菌株進行編號,將純化后的菌株接種于相應的液體培養基中分別培養24 h,最后保存在25%(體積分數)甘油中凍藏于-20 ℃冰箱備用。

1.3.3 產生物胺菌株的篩選

參考蒙菊[11]的方法,氨基酸肉湯培養基(1 L):5 g胰蛋白胨、5 g酵母浸粉、氨基酸各5 g(色氨酸、組氨酸、酪氨酸、賴氨酸、鳥氨酸、精氨酸),5 g NaCl、0.06 g溴甲酚紫、1 g葡萄糖、0.2 g MgSO4·7H2O、0.05 g MnSO4·4H2O、0.04 g FeSO4·7H2O、0.1 g CaCO3、0.5 mL吐溫-80、0.05 g磷酸吡哆醛,最后用1 mol/L HCl溶液將pH調至5.3左右。

將分離純化得到的菌株活化后,分別接種于氨基酸肉湯培養基中,同時設立空白對照,在37 ℃溫度下培養48 h,觀察培養基顏色變化。空白對照培養基顏色呈棕色,若培養基呈紫色或酪氨酸沉淀消失,表示待測菌株為產胺陽性菌,若培養基呈黃色,表示待測菌株為產胺陰性菌。

1.3.4 產生物胺菌株的鑒定

將產生物胺陽性菌株分別接種于LB肉湯培養基中,于37 ℃活化培養24 h,10 000 r/min離心10 min獲取菌體,后送至擎科生物科技有限公司進行提取、純化、擴增與測序。選擇通用引物27F:5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′;1492R:5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′進行PCR擴增,將測序結果與NCBI數據庫序列進行BLAST同源性檢索,利用MEGA11進行比對分析后構建系統發育樹,以確定菌株種屬。

1.3.5 產生物胺菌株的產胺能力分析

將產生物胺陽性菌株按相同體積分數接種于氨基酸肉湯培養基中,37 ℃培養48 h,將培養液離心(10 000 r/min,15 min)后取上清液進行稀釋,取1 mL稀釋液利用高效液相色譜儀進行生物胺含量測定。生物胺測定方法參考GB 5009.208—2016《食品安全國家標準 食品中生物胺的測定》及翟鳳梅等[12]的方法,并稍作修改。

1.3.5.1 標準曲線的制作

首先分別將6種生物胺標準品(色胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺)用0.1 moL/L HCl溶液配制成1 mg/mL的標準儲備溶液,再將標準儲備溶液混合配制為100 mg/L的標準混合使用液。將標準混合使用液分別稀釋為2.5、5、10、15、25、50 mg/L的生物胺混標使用液,對生物胺混標使用液進行衍生化后上機測定,制得生物胺標準曲線。

1.3.5.2 樣品衍生化

取1 mL待測樣品稀釋液,依次加入200 μL 2 mol/L NaOH、300 μL飽和NaHCO3溶液、2.0 mL丹磺酰氯溶液(10 mg/mL),在40 ℃水浴條件下暗反應45 min,然后加入100 μL的氨水終止衍生化反應,最后用乙腈定容至5 mL,過孔徑為0.22 μm的有機系濾膜于進樣瓶中,利用高效液相色譜儀進行分析檢測。

1.3.5.3 色譜條件

色譜柱:Sepax HP C18;流動相A超純水;流動相B乙腈;流速0.8 mL/min;紫外檢測波長254 nm;柱溫35 ℃;進樣量20 μL;采用梯度洗脫,洗脫程序共35 min,包括5個階段,在0～15 min,A流動相體積分數由30%降為25%,B流動相體積分數則由70%上升到75%;在15～20 min,A流動相體積分數由25%降至20%,B流動相體積分數則由75%上升到80%;在20～25 min,A流動相體積分數由20%降至10%,B流動相體積分數則由80%上升到90%;在25～28 min,A流動相體積分數由10%升至25%,B流動相體積分數則由90%降到75%;在28～35 min,A流動相體積分數由25%升至40%,B流動相體積分數則由75%降到60%。

1.3.6 環境因子對生物胺菌株產胺能力的影響

根據泡菜發酵工藝結合微生物生長條件,設置具有不同梯度pH值(3.5、4.5、5.5和6.5)、鹽度(20、40、60和80 g/L)和溫度(10、20、28和37 ℃)的氨基酸肉湯培養基,將具有代表性的高產胺菌株活化后,取1 mL菌懸液按照體積分數10%接種至氨基酸肉湯培養基中,37 ℃(溫度梯度組除外)靜置培養48 h,對培養液進行離心稀釋后待測。

1.4 數據處理

采用Excel 2016對試驗數據均值和標準差進行計算,利用SPSS 26對試驗數據間的顯著性進行分析,顯著水平為P<0.05,使用Origin 2021進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 泡菜中產生物胺菌株的分離篩選

如圖1所示,在泡菜發酵過程中,經分離純化后得到77株菌株,包括43株乳酸菌、26株腸桿菌和8株酵母菌。將菌株活化后分別接種于氨基酸肉湯培養基中培養48 h,觀察培養基顏色變化,呈紫色為產胺陽性菌株。經過初步篩選,發現共26株細菌具有形成生物胺的能力,包括20株腸桿菌和6株乳酸菌。

圖1 氨基酸肉湯培養基顯色結果

2.2 泡菜中產生物胺菌株的鑒定

利用16S rRNA基因測序技術對初篩得到的26株產生物胺陽性菌進行鑒定,26株菌株分別屬于8個不同種屬,其中包括10株腸桿菌(Enterobactersp.)、4株克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)、2株勒克氏菌(Leclerciasp.)、2株萊略特菌(Lelliottiasp.)、1株假檸檬酸鹽桿菌(Pseudocitrobactersp.)、1株泛菌(Pantoeasp.)、5株魏斯氏菌(Weissellasp.)、1株乳桿菌(Lactiplantibacillussp.),選擇不同種屬的代表菌株進行系統進化樹構建,如圖2所示。相關研究表明,腸桿菌是四川泡菜中中除乳酸菌株外數量最多的細菌,也是發酵蔬菜中常見的產生物胺菌屬[13-14]。

圖2 產胺菌株16S rRNA基因系統發育樹

2.3 產生物胺菌株產胺能力分析

2.3.1 生物胺標準樣品的色譜圖及線性回歸方程

圖3是生物胺混合標品HPLC色譜峰圖,可以看出6種生物胺在35 min內可以得到很好的分離,每個峰形都是獨立且對稱的,基線平穩無拖尾現象,說明樣品中的生物胺可在此方法下進行良好的分離檢測。

1-色胺;2-腐胺;3-尸胺;4-組胺;5-酪胺;6-亞精胺

以峰面積(y)為縱坐標,生物胺標品濃度(x)為橫坐標進行標準曲線的繪制,具體信息如表1所示,6種生物胺在2.5～100 mg/L質量濃度范圍內,峰面積與濃度之間具有良好的線性關系,且相關系數都高于0.999 5,表明此方法可以有效地對樣品中的6種生物胺進行測定。

表1 生物胺標準曲線回歸方程、相關系數及線性范圍

2.3.2 產胺菌株產胺含量檢測結果

將初篩得到的26株產胺陽性菌株分別接種于5 g/L的氨基酸肉湯培養基于37 ℃下培養48 h,利用高效液相色譜儀對培養液中的生物胺進行檢測,具體結果如表2所示。可以發現,篩得的菌株以產腐胺和尸胺為主,具有產生物胺能力的乳酸菌產總胺含量均低于10 mg/L,而20株腸桿菌的生物胺產量均超過了1 000 mg/L,其中C7菌株產胺能力最強,產胺量高達7 400.13 mg/L,且是唯一具有產組胺能力的菌株。這與相關研究結果類似,蒙菊[11]對分離自發酵酸魚中的腸桿菌、乳酸菌和葡萄球菌的產胺性能進行了研究,發現腸桿菌的產生物胺活性遠強于其他菌株。李梅等[15]研究發現,腐胺和尸胺是四川泡菜中的含量最高的2種生物胺。因此,對于生物胺的防控來說,雖然在整個泡菜發酵過程中乳酸菌數量占有絕對優勢,但在發酵初期占一定優勢的腸桿菌才是對生物胺積累有重要貢獻的菌群[16],因此選擇5株(C3、C6、C7、C16、C19)具有代表性的高產胺腸桿菌菌株作進一步研究,其中C6株和C19株為腸桿菌屬,C3、C7、C16為克雷伯氏菌屬。圖4為部分菌株生物胺測定色譜峰圖。

表2 菌株產生物胺能力的測定結果

a-C3;b-C6;c-C7;d-C16;e-C19

2.4 環境因子對產胺菌株產胺能力的影響

在泡菜發酵過程中,多種因素共同決定了生物胺含量的高低,包括前體游離氨基酸含量、產胺微生物種類與數量、微生物生長與產胺環境條件等。環境條件對產胺微生物生長及產酶活性影響明顯,不同環境條件下產胺菌株的產胺能力有很大的差別。為了具體探究泡菜中產胺菌株在不同生長環境下的產胺特性,共挑選了5株高產胺腸桿菌菌株在不同pH、鹽度和溫度下分別進行培養,對培養液中生物胺含量進行了分析。

2.4.1 pH對產胺菌株產胺能力的影響

pH值高低決定了泡菜發酵過程中微生物菌群的組成結構,根據泡菜發酵過程中pH值變化情況,設置了3.5、4.5、5.5、6.5四個pH梯度,以探究pH值對產生物胺菌株產胺能力的影響。如圖5所示,5株菌株在pH 4.5或pH 5.5時產胺量最高,這可能是由于在較低pH環境下,產胺菌株生長受到抑制,誘導其分泌氨基酸脫羧酶對游離氨基酸進行脫羧反應,生成呈堿性的生物胺以抵抗低酸環境對菌株自身生長造成的影響[17]。而較高pH環境會導致對應氨基酸脫羧酶基因表達量降低,過低的pH值會嚴重影響菌株生長繁殖以及酶活性。

a-腐胺;b-尸胺;c-組胺

除了C7株外,其他4株菌在pH 3.5時幾乎沒有生物胺產生,說明低pH值對生物胺的形成有很大影響,低pH可強烈抑制菌株形成生物胺。因此,在泡菜發酵過程中可以考慮外源添加有機酸或接種優良發酵劑以快速降低泡菜發酵體系的pH值,減少生物胺的積累[18-19]。

2.4.2 鹽度對產胺菌株產胺能力的影響

鹽度是泡菜發酵過程中的重要理化指標,不僅可決定泡菜口感和風味,還會影響微生物的生長代謝[20]。由圖6可知,腐胺和組胺的含量隨鹽度的升高而明顯減少,鹽度對于腐胺和組胺的形成有強烈的抑制作用,當鹽度升高至80 g/L時,幾乎無腐胺和組胺產生,這一研究結果與呂佳良[21]的結論相似。

a-腐胺;b-尸胺;c-組胺

尸胺的產量受鹽度的影響則相對較小,C3菌株在20 g/L和40 g/L鹽度下的尸胺產量未表現出較為明顯的差異,而C7株、C16株和C19株在鹽度提高至60 g/L時,其尸胺產量都未出現明顯降低,這可能是由于負責形成尸胺的賴氨酸脫羧酶的分子結構對Na+的耐受性更高而導致的,Na+可以作用于氨基酸脫羧酶的肽鍵,通過破壞酶分子結構而使其酶活性降低[22]。所以只有將鹽濃度控制在80 g/L及以上時,才能整體上最大程度地減少生物胺的積累。

2.4.3 溫度對產胺菌株產胺能力的影響

溫度是泡菜發酵過程中影響微生物生長和酶活的關鍵環境因子之一。如圖7所示,不同菌株產生物胺含量受溫度影響程度不同,同一菌株在產生不同種類生物胺時受溫度影響也不同。其中,大部分產胺菌株的鳥氨酸脫羧酶及組氨酸脫羧酶活性受溫度影響較為明顯,與10 ℃相比,提高發酵溫度增加了腐胺和組胺的生成量。而菌株產尸胺能力受溫度的影響則較低,在10 ℃時已經具備較強的產胺能力,而C7菌株更是有著比其他溫度下更強的產尸胺能力,可能是由于賴氨酸脫羧酶在較低溫度下就能夠發揮足夠的活性。有研究也證明了這一現象,CVETKOVI等[23]發現較高溫度可以加快發酵甘藍中生物胺的積累,且對腐胺和組胺的形成更為顯著。

a-腐胺;b-尸胺;c-組胺

3 結論

本試驗以傳統四川泡菜為原料,利用氨基酸肉湯培養基從泡菜發酵過程中篩選得到26株產胺菌株,利用16S rRNA基因技術,結合NCBI進行同源性搜索比對,鑒定26株來自于腸桿菌屬、克雷伯氏菌屬、勒克氏菌屬、假檸檬酸鹽桿菌屬、萊略特菌屬、泛菌屬、魏斯氏菌屬和乳桿菌屬共8個屬。利用高效液相色譜對菌株的產生物胺能力分析,發現腸桿菌具有很強的產胺能力,主要產胺種類為腐胺和尸胺,腐胺、尸胺和組胺最高生成量分別達到了4 829.67、2 987.84和2 212.52 mg/L。對其中高產胺菌株產胺特性研究發現,pH值和鹽度可以顯著降低生物胺含量,菌株產胺能力受溫度影響相對較小,當pH為3.5或鹽度為80 g/L時,大部分菌株基本無法產生物胺。相比較而言,鳥氨酸脫羧酶對pH、鹽度和溫度都比較敏感,組氨酸脫羧酶則對鹽度更為敏感,而賴氨酸脫羧酶則對pH更敏感。

以上研究結果為控制四川泡菜中生物胺的積累提供了一定理論參考,但鑒于不同菌株對環境的抗逆性存在差異性,要更好地達到限制泡菜中生物胺的目的,不能只依靠單一的因素對產胺菌株進行限制,還應當考慮添加更多的柵欄因子共同作用,如具有抑菌作用的香辛料、優良發酵劑及胺氧化酶等。