肌酐酶在大腸桿菌中外源表達及發酵優化

周麗亞,張悅,劉瑞琪,陳佳立,劉運亭,姜艷軍,馬麗

(河北工業大學 化工學院,天津,300000)

近年來,肌酐作為基本的生化標志物在檢測腎臟狀況中的應用廣泛,可以為臨床提供腎臟功能相關的定性和定量數據。腎臟通過腎小球超濾來清除血漿中的肌酐以維持體內的動態平衡,腎臟會清除血液中的肌酐,但隨著腎功能的下降,肌酐水平會上升,因此肌酐含量是腎臟功能最重要的生化指標[1]。肌酐測定試劑盒由于具備操作簡單、處理速度快、反應敏感度高等優點,目前被廣泛應用于肌酐的常規檢測。該試劑盒按照檢測原理主要分為酶法和苦味酸法[2]2種,相比較而言,酶法抗干擾性能較好、準確度高且交叉污染相對少,可為臨床診斷提供可靠的數據支持。其中肌酐酶(EC 3.5.2.10,creatininase,CA)、肌酸酶(EC 3.5.3.3,creatinase,CI)以及肌氨酸氧化酶(EC 1.5.3.1,sarcosine oxidase,SOX)是用于酶法檢測肌酐的關鍵工具酶,但酶法試劑盒中的關鍵工具酶目前還主要依賴進口,國產CA發酵產量低且穩定性不佳[3-4],致使肌酐檢測試劑盒生產成本一直居高不下。為了降低成本和減輕患者負擔,研究與開發活性高、穩定性好的產CA菌株,并通過發酵條件優化提高表達量,對推動其在肌酐檢測試劑盒中的應用尤其重要。

CA分子質量在29 kDa左右,主要來源于假單胞菌和節桿菌。TANG等[5]和陶政宇等[6]分別實現了惡臭假單胞桿菌(Pseudomonasputida)來源的CA在大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草芽孢桿菌的表達,但由于純化時需要兩步柱層析,操作繁瑣、損失較大,導致胞內蛋白回收率比較低;且枯草芽孢桿菌胞外分泌蛋白較少,蛋白純化回收的方法尚不明確,未得到純蛋白。大腸桿菌代謝網絡研究清晰,且培養條件簡單易操作、發酵時間成本低,成為目前最熱門的外源表達宿主。本研究全基因合成來源于P.putida的CA基因,并根據大腸桿菌密碼子偏好性進行優化,實現了其在E.coliBL21(DE3)中的可溶性表達,對重組菌發酵條件和酶學性質進行了研究,并完成了在5 L發酵罐中的初步放大生產,以期為CA的工業生產提供理論依據及技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌種

實驗室構建的基因工程菌E.coliBL21(DE3)pET28a-CA菌株。

1.1.2 基礎培養基

Terrific-Broth(TB)液體培養基(g/L):胰蛋白胨12,酵母浸粉24,87%(體積分數)甘油4 mL/L,K2HPO40.072 mol/L,KH2PO40.017 mol/L(調節至pH 6.5);Luria-Bertani(LB)液體培養基(g/L):胰蛋白胨10,NaCl 10,酵母浸粉5;LB固體培養基:在LB液體培養基的基礎上,加入15 g/L瓊脂粉。上述所需培養基均在121 ℃滅菌30 min后備用。

1.1.3 儀器與設備

XMTD-204數顯恒溫水浴鍋,常州智博瑞儀器制造有限公司;ZWY-200D恒溫培養振蕩器,上海智誠分析儀器制造有限公司;GS-LH300高壓勻漿機,格瑞特康生物有限公司;D/37520高速控溫離心機,德國艾本德公司;UV-1100紫外可見分光光度計,美普達儀器有限公司;LRH-1000F生化培養箱,上海一恒科學儀器有限公司;DYY-6C電泳儀,北京市六一儀器廠;5BG離位滅菌玻璃發酵罐,上海保興生物設備工程有限公司;GI54T立式壓力蒸汽滅菌器,致微儀器有限公司。

1.1.4 主要實驗藥品

異丙基β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG),日本寶生物公司;胰蛋白胨、酵母浸粉、過硫酸銨,北京奧博星生物技術有限公司;考馬斯亮藍R250,上海化學試劑公司;硫酸卡那霉素,北京索萊寶科技有限公司;NaOH、KH2PO4、K2HPO4、Na2CO3、三羥甲基氨基甲烷(Tris),天津市風船化學試劑科技有限公司;β-巰基乙醇,卡邁舒生物科技有限公司;HCl,天津津海華興有限公司;CI和SOX均來自本課題組實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組表達菌株的構建

CA基因片段源自于GenBank數據庫(GenBank:D45424.1)已知的CA(P.putida1978)的基因序列[4],委托金唯智生物科技有限公司合成并根據大腸桿菌中密碼子的偏好性完成密碼子優化。質粒的構建如圖1所示,載體為pET-28a,酶切位點分別為NcoI和XhoI,抗性基因選用Kan,將重組質粒導入到E.coliBL21(DE3)中。

圖1 重組質粒構建示意圖

1.2.2 種子活化與搖瓶發酵

利用-80 ℃冰箱保藏的CA菌種在固體LB培養基劃線培養,挑取單菌落在10 mL LB液體培養基中,37 ℃恒溫培養18 h得到一級種子;將一級種子按照1%(體積分數,下同)接種量接種在50 mL LB液體培養基中,37 ℃下培養6 h得到二級種子。

搖瓶培養條件:按1%接種量將一級種子接種于50 mL TB培養基中,補加卡那霉素至終質量濃度為50 μg/mL,待其生長至OD600=0.8,加入終濃度為0.2 mmol/L IPTG進行誘導培養,20 ℃誘導培養20 h。

1.2.3 酶液的收集

發酵完畢后,4 ℃、8 000 r/min離心收集菌體,使用0.1 mol/L的Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液將發酵菌體洗滌2遍后,使用1/3發酵液體積的Tris-HCl(pH 8.0)緩沖液重懸菌體,用細胞勻漿機破碎細胞,破碎完畢后,離心去除下層細胞碎片沉淀,上清液即為粗酶液。

1.2.4 SDS-PAGE驗證

發酵完成后,收集粗酶液,蛋白電泳的樣品和Marker的上樣量分別為8、5 μL,在105 V電壓下運行20 min,然后加壓至155 V,膠片用考馬斯亮藍染色40 min,利用凝膠成像儀觀察CA目的蛋白表達情況。

1.2.5 酶活力的測定

CA活性的檢測原理:底物肌酐在CA作用下水解生成肌酸,與在弱堿性條件下α-萘酚被雙乙酰氧化生成的α-萘醌反應生成熒光化合物,該熒光產物可在525 nm波長下進行吸光值測定[6-7]。

檢測試劑:0.2 mol/L Tris-HCl緩沖溶液(pH 8.0);0.1 mol/L肌酐溶液;2 g Na2CO3溶于50 mL雙蒸水;1 g α-萘酚溶于50 mL無水乙醇;0.6 g NaOH和1.6 g Na2CO3溶于50 mL雙蒸水;25 μL二乙酰溶于50 mL雙蒸水。檢測方法:取100 μL Tris-HCl緩沖溶液和800 μL肌酐溶液至試管中,37 ℃靜置5 min;加入100 μL粗酶液,混勻后于37 ℃孵育10 min,后加入2 mL Na2CO3溶液終止反應,移取100 μL反應液,依次加入900 μL雙蒸水、500 μL α-萘酚溶液、500 μL NaOH溶液、500 μL二乙酰溶液,25 ℃孵育20 min;加入2.5 mL雙蒸水在525 nm處測定OD值,以滅活酶液(沸水浴5 min)為空白對照。

酶活力定義為:在37 ℃的反應液中,水解底物產生1 μmol肌酸所需的CA的量為1個酶活力單位(U)。單位體積(mL)酶液所具有的酶活力單位定義為毫升酶活力(U/mL)。比酶活力為單位質量(mg)蛋白質所具有的酶活力(U/mg),蛋白質濃度采用考馬斯亮藍法測定。

1.3 搖瓶發酵培養基優化

1.3.1 單因素試驗

以TB培養基作為基礎培養基,對培養基中的主要成分進行優化,以菌體生長狀況和CA活力作為評價標準,依次對碳源種類及濃度、氮源種類及濃度、磷酸鹽濃度進行單因素優化試驗[8]。

1.3.2 Box-Behnken試驗設計(BBD)與結果驗證

采用BBD的響應面分析法對各因素及其交互作用的影響進行評價,響應面分析是一種用于建立多變量方程和評估變量的最優值的統計技術[9-11],可考察培養基中各組分之間交互作用對發酵效果的影響。數據處理應用Design Expert 8.0.6軟件,通過軟件找出4個選定變量之間的交互作用,每個變量都在3個不同的水平上進行了分析,4個變量的中心編碼值為零(表1)。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平編碼

根據BBD試驗設計獲得的實驗結果數據與模型進行擬合分析確定回歸方程的極值點及相應的自變量取值,并進行搖瓶驗證實驗,重復3次。根據搖瓶驗證結果驗證模型的可靠性,最終確定優化結果。

1.4 5 L發酵罐培養條件優化

發酵罐培養條件:利用優化后的培養基,將二級種子按1%～7%的體積分數接入5 L發酵罐中,固定發酵溶氧值(dissolved oxygen,DO)10%～30%,設置轉速和溶氧值串聯,通氣量為6 L/min,罐內溫度設置為37 ℃,待菌株發酵培養至OD600=1.8加入IPTG誘導培養,使加入的IPTG在發酵液中的終濃度為0.05～0.6 mmol/L,設定罐內溫度20～30 ℃以利于工程菌株表達CA。誘導培養10～24 h后,4 ℃、8 000 r/min離心5 min收集菌體。

1.5 數據處理與分析

采用Design Expert 8.0.6軟件進行Box-Behnken實驗設計、數據處理和分析,采用Origin 8.0軟件編輯繪圖。

2 結果與分析

2.1 CA的SDS-PAGE驗證

經SDS-PAGE測定,結果如圖2所示,M為蛋白質標準條帶(marker),1號泳道為重組菌株表達后細胞破碎上清液,2號泳道為重組菌株全細胞,3號泳道為空載質粒pET-28a表達后細胞破碎上清粗酶液,結果表明CA是胞內酶,分子質量大約為29 kDa,與相關文獻報道一致[4],說明重組菌株的成功構建。

圖2 誘導表達后的CA的SDS-PAGE分析

2.2 培養基優化

大腸桿菌的發酵一般利用TB培養基,但其中的氮源、碳源、無機鹽等對菌體生長有重要的影響,不同的菌體對各種元素的需求量不同,為了提高發酵產量,本文以TB培養基為基礎培養基,對培養基的各組分進行優化。

2.2.1 培養基碳源的選擇和用量的優化

在50 mL基礎培養基中,分別加入相同質量濃度(10 g/L)的甘油、葡萄糖、乳糖、蔗糖、淀粉作為碳源。不同碳源對重組菌的生長與產酶情況如圖3-a所示,當以乳糖作為碳源時,雖然菌體比酶活力很高,但是菌體生長狀況不佳,同一批次總酶活力產出遠遠低于其他碳源。以葡萄糖作為碳源時,總產酶水平與甘油基本持平,考慮到葡萄糖的成本遠遠低于甘油,因此選擇葡萄糖作為培養基的碳源。如圖3-b所示,在葡萄糖質量濃度的不斷增加過程中,重組菌產酶總體水平顯現出先增高后降低的趨勢,菌體量基本持平,可能由于高濃度葡萄糖抑制CA的表達[12],當葡萄糖質量濃度為10 g/L時,CA活力達到最高值252.53 U/mL,所以最終選用10 g/L的葡萄糖作為最佳碳源。

a-碳源種類;b-葡萄糖濃度

2.2.2 培養基氮源的選擇和用量的優化

在50 mL基礎培養基中,分別加入相同質量濃度(10 g/L)的尿素、NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、酵母浸粉、胰蛋白胨作為氮源。

由圖4-a可知,以尿素、NH4NO3、(NH4)2SO4和NH4Cl作為氮源時,菌體的生長情況較差,說明無機氮源營養物質不利于菌株利用,另外發酵過程中由于菌體利用無機氮源后會使發酵液的pH下降,不利于CA的表達。無機氮源中,以(NH4)2SO4為氮源的生長量最低,菌體的生長緩慢也導致其酶活力較低。以胰蛋白胨和酵母浸粉作為氮源時,可以發現使用有機氮源菌體生長量和CA活力都明顯優于使用無機氮源,而且胰蛋白胨優于酵母浸粉,這是由于其含有多種菌體生長需要的維生素和生長因子以及礦物元素,與文獻報道一致[13]。因此,本實驗選擇酵母浸粉與胰蛋白胨作為氮源。

a-氮源種類;b-酵母浸粉濃度;c-胰蛋白胨濃度

如圖4-b所示,隨著酵母浸粉質量濃度增大,菌體量呈現出先上升后下降的趨勢,在酵母浸粉質量濃度為20 g/L時,菌體量基本達到最大值。在酵母浸粉質量濃度>25 g/L時,菌體量大幅度下降,可能由于高濃度的酵母浸粉含有過量的氨基酸,從而抑制了重組菌的生長[14]。另外CA活力也隨著酵母浸粉濃度增加呈先上升后下降的態勢,酵母浸粉質量濃度為20 g/L時,CA活力達到最高值330.78 U/mL,之后酶活力下降,因此選用20 g/L酵母浸粉有利于CA的表達。

如圖4-c所示,隨著胰蛋白胨質量濃度不斷增大,CA活力呈現先上升而后降低的狀態,胰蛋白胨質量濃度為15 g/L時,CA活力達到最高值405.16 U/mL。綜上最終選擇15 g/L的胰蛋白胨,20 g/L的酵母浸粉作為培養基氮源。

2.2.3 培養基磷酸鹽用量的優化

在50 mL基礎培養基中,分別控制磷酸鹽的終濃度為40～220 mmol/L,探究磷酸鹽濃度對菌體產酶情況的影響,結果如圖5所示。在磷酸鹽濃度增加的過程中,菌體濃度并沒有產生較大波動,酶活力出現了先增加后降低的趨勢,可能是由于高濃度磷酸鹽對CA的生產產生了抑制作用,無機磷促進初級代謝,而過量的磷酸鹽會抑制許多抗生素和其他次生代謝物的生物合成[15],不利于CA的生產。實驗發現磷酸鹽在130 mmol/L時菌體生長狀況與其他濃度基本持平,但是此時的酶活力達到最高326.77 U/mL。因此,本實驗最終選擇磷酸鹽終濃度為130 mmol/L。

圖5 磷酸鹽濃度對發酵的影響

2.3 響應面優化培養基成分及結果驗證

在單因素試驗的基礎上,選擇葡萄糖、酵母浸粉、胰蛋白胨和磷酸鹽濃度作為變量,并用BBD確定了影響CA產量的4個因素的最優水平[16]。對葡萄糖(7.5、10、12.5 g/L)、酵母浸粉(17.5、20、22.5 g/L)、磷酸鹽(115、130、145 mmol/L)和胰蛋白胨(12.5、15、17.5 g/L)進行29組實驗(表2)。經過Design Expert 8.0.6對方差分析(表3)和交互作用分析,優化的培養基組葡萄糖、酵母浸粉、磷酸鹽和胰蛋白胨濃度分別為10.33 g/L、21.80 g/L、137.63 mmol/L和15.60 g/L時,該模型預測的CA活力為406.66 U/mL。

表3 CA活力響應面模型的方差分析

根據得到的結果,考慮到操作可行性,將理論培養基最佳條件調整為:葡萄糖10.30 g/L、酵母浸粉21.80 g/L、磷酸鹽137.60 mmol/L、胰蛋白胨15.60 g/L。利用優化后的培養基在搖瓶水平通過3組平行實驗驗證結果,3組驗證實驗的CA活力平均值為401.76 U/mL,與回歸模型預測的最大酶活力406.66 U/mL的相對誤差為1.14%,表明本實驗得出的回歸模型合理、可信。響應面優化前單因素下發酵產CA活力最大為326.77 U/mL,優化后重組菌株生產的CA活力比優化前增大了22.95%。優化后的發酵培養基降低了成本,可大幅度提高CA活力,縮減培養周期,提高了發酵效率。

2.4 5 L發酵罐反應條件的優化

全自動發酵罐中的發酵培養過程的高度非線性和復雜特性是由于微生物的非線性生長行為造成的。此外,微生物的代謝機制非常復雜,對培養環境非常敏感。環境的微小變化會導致不同的代謝途徑,因此對發酵罐培養中影響微生物生長和代謝過程的條件,包括IPTG濃度、接種量、溫度和溶解氧濃度等的優化非常重要[17-18]。

2.4.1 IPTG濃度對重組菌生長狀況和CA活力的影響

以IPTG為誘導劑的T7啟動子表達系統已被廣泛應用于大腸桿菌中異源蛋白的表達,T7啟動子可以幫助重組菌有效表達外源蛋白CA。如圖6-a所示,IPTG在低濃度(0.05～0.2 mmol/L)時酶活力隨著IPTG濃度的增加而增加,濃度增加至0.2 mmol/L時,CA活力達到最大值401.76 U/mL。IPTG濃度的增加能使CA的表達量和菌體量增加,但超過0.2 mmol/L之后,對CA活力和菌體量都有一定負面影響,這種影響在其他文獻中也有報道[19-20]。因此,以0.2 mmol/L的誘導劑作為最佳誘導濃度。

a-IPTG濃度;b-接種量;c-溫度和時間;d-溶氧

2.4.2 接種量對重組菌生長狀況和CA活力的影響

大腸桿菌的生長和代謝也受接種量的影響,合適的接種量對菌體的快速生長和發酵產物的合成有積極的作用。如圖6-b所示,發酵罐的接種量對菌體量沒有明顯影響,接種量4%發酵18 h后CA的活力達到最大值。但當接種量過大時,CA活力下降,這可能是由于菌體濃度增長過快,過早進入穩定期,發酵液中溶解氧較低,抑制了CA的表達。隨著接種量的增加,菌體濃度也增加,當接種量為6%時,菌體濃度達到最大。隨著接種量的增加,菌體濃度開始下降,這可能是由于接種量較高時,發酵液中起始菌體濃度較高,培養基中營養成分消耗較快。綜上,最佳接種量為4%。

2.4.3 發酵誘導溫度和時間對重組菌生長狀況和CA活力的影響

菌體的繁殖需要適宜的溫度,過高或過低都會影響菌體的產酶活性和代謝,抑制菌體的生長。本實驗將誘導溫度溫度分別控制在20、25、30 ℃,由圖6-c可知,溫度對CA活力有顯著影響。溫度過高和過低都會降低CA活力,在超過25 ℃時,下降明顯。結果表明,重組菌株在高溫和低溫條件下都不適合發酵,因此確定25 ℃為最佳發酵溫度。

如圖6-c可知,菌體在發酵初期呈對數生長,中后期積累代謝產物,穩定生長后逐漸衰老。發酵液中的CA菌體量在18 h前隨發酵時間的延長而增加,在18 h時達到最高。18 h后,菌體量開始下降,可能是由于營養供應不足所致。結果表明,最佳發酵時間為18 h。

2.4.4 DO濃度對重組菌生長狀況和CA活力的影響

DO作為影響大腸桿菌發酵的一個重要因素已被廣泛研究[21]。如圖6-d所示,DO為40%時,充足的O2供應可以為CA的合成提供更多的能量,提高重組菌代謝的速度。由于O2量充足,在14 h時菌體量達到最大,后隨著時間的增長,菌體逐漸降低,過高的DO水平會加速細胞的衰亡,可能與過量O2的毒性作用有關,也可能是出現自溶的現象。當DO在20%時,菌體生長速度較慢。在DO為30%時酶活力達到最高470.24 U/mL,在18 h菌體量也基本達到最大,因此,選擇在30% DO條件下進行發酵。

通過對發酵罐培養條件的優化,確定在0.2 mmol/L IPTG、4%接種量、DO維持在30%、在25 ℃下誘導18 h進行發酵培養,CA活力可達到470.24 U/mL,經過計算得到CA比酶活力達到367.38 U/mg,與搖瓶培養條件下相比,CA活力得到顯著提高,有利于在工業中實現放大生產。

3 結論與討論

肌酐酶作為一種重要的體外診斷酶制劑,醫學臨床需求量大,但野生菌株產肌酐酶活性不穩定、產量低,工業放大難度大,這些因素限制了酶法檢測肌酐技術的推廣。為了提高肌酐酶的產量和穩定性,潘華平等[7]利用酵母表達系統通過酵母孢子微膠囊固定化肌酐酶,提高了酶活性和重復使用性;陶政宇等[6]在枯草芽孢桿菌胞外表達肌酐酶,比酶活力為238 U/mg;趙更峰等[22]分離得到一株節桿菌(Arthrobactersp.)可產肌酐酶,經過多步純化后比酶活力為209.10 U/mg。本文利用來源于P.putida的肌酐酶基因實現在大腸桿菌中外源表達,對重組工程菌的發酵培養基和發酵條件進行優化,首先在搖瓶培養水平上對發酵培養基營養成分種類和濃度進行了單因素優化,再通過BBD實驗對各個因素進行響應面優化設計,得到發酵培養基的組成:葡萄糖10.30 g/L、酵母浸粉21.80 g/L、磷酸鹽137.60 mmol/L、胰蛋白胨15.60 g/L,此時搖瓶培養肌酐酶的酶活力為401.76 U/mL。并在5 L發酵罐中,對發酵條件進行優化:接種量為4%,誘導溫度為25 ℃,誘導時間為18 h,IPTG濃度為0.2 mmol/L,溶氧值控制在30%,菌體濃度與酶活力有了進一步的提升,經細胞破碎后,粗酶液中酶活力為470.24 U/mL,此時比酶活力達到367.38 U/mg,肌酐酶活性得到了明顯提升,研究結果為之后的工業化提供了理論基礎。