代謝改造大腸桿菌合成8-異戊烯基山奈酚

趙婉瑩,周景文,侯穎*

1(天津科技大學 生物工程學院,天津,300000)2(江南大學 生物工程學院,江蘇 無錫,214122)

異戊烯基化類黃酮屬于類黃酮類物質[1],其以類黃酮為骨架通過C—C鍵或C—O鍵與親脂性的異戊烯基側鏈相連構成[2],而異戊烯基修飾對提高類黃酮物質的生物活性具有重要意義[3]。8-異戊烯基山奈酚是山奈酚8-C異戊烯基化的衍生物,主要存在于豆科植物(苦參)和小檗科植物(淫羊藿)[4-5]。8-pk具有多種生物活性,如抗氧化、保護心血管[6]和降血糖[7]等。目前8-pk主要通過植物提取、化學合成和生物合成得到。相比于天然植物提取和化學合成,生物合成異戊烯基類黃酮具有反應條件溫和、操作簡單、選擇性高和環境友好等優點。因此開發綠色高效的生物合成8-pk體系符合當今中國的“雙碳”政策和可持續發展理念。

異戊烯基轉移酶是黃酮類化合物異戊烯基化修飾過程中的關鍵酶,其自身具有的膜定位信號肽可將異戊烯基轉移酶定位于細胞中不同的細胞器或細胞膜等亞細胞結構[8]。本研究團隊在前期挖掘了淫羊藿來源的EkF8DT,能夠識別山奈酚(kaempferol, Kae)進而合成8-pk,這為8-pk的高效生物合成提供了基礎。現有的研究已在釀酒酵母中首次實現了8-pk的從頭合成,通過截短N端信號肽和強化甲羥戊酸途徑(mevalonate pathway,MVA)等方式,可生產25.9 mg/L的8-pk[9]。但其存在發酵周期長、生產效率低、生產成本高等問題,難以實現工業化生產。E.coli作為實驗室和工業常用的菌株,因其生長迅速、技術操作簡單和遺傳工具發展成熟的優勢而成為良好的底盤菌株。

異戊烯基轉移酶可以從不同的供體來獲得異戊烯基,其中以二甲基丙烯基二磷酸(dimethylallyl pyrophosphate,DMAPP)為主要的供體。DMAPP可由MVA途徑和甲基赤蘚糖醇4-磷酸途徑(methylerythritol 4-phosphate pathway,MEP)合成。E.coli中DMAPP通過MEP途徑產生,但是該途徑代謝強度較弱,導致DMAPP供給不足,限制了產物的高效合成。異戊烯醇利用途徑(isopentenol utilization pathway,IUP)可以分別以3-甲基-3丁烯-1-醇或3-甲基-2丁烯-1-醇作為原料,分2步生成異戊烯基二磷酸(isopentenyl diphosphate,IPP)和DMAPP(圖1)。IUP途徑由釀酒酵母來源的膽堿激酶(choline kinase fromSaccharomycescerevisiae,ScCK)、擬南芥來源的異戊烯磷酸激酶(isopentenyl phosphate kinase fromArabidopsisthaliana,AtIPK)和異戊烯焦磷酸異構酶(isopentenyl-pyrophosphate delta isomerase,IDI)組成,ATP是其唯一輔因子。研究表明通過表達膽堿激酶(choline kinase,CK)和磷酸異戊烯基激酶(isopentenyl phosphate kinase,IPK)引入了IUP途徑使β-胡蘿卜素產量增加23%[10]。通過對比IUP途徑與MVA途徑發現,IUP能夠快速獲得IPP和DMAPP,從而將IPP和DMAPP水平提高15.7倍[11]。而MVA途徑會消耗大量的能量,因此,通過引入IUP途徑來提高DMAPP的供給,是高效生物合成8-pk的關鍵。此外,將異戊烯基轉移酶進行N端的截短是提高其催化性能的常見手段[12]。通過截短前40和80個氨基酸殘基使得8-異戊烯基柚皮素的產量提高了44.2%和119.1%[13]。

G3P:3-磷酸甘油醛;dxs:1-脫氧木酮糖-5-磷酸合成酶;ispC:1-脫氧木酮糖-5-磷酸還原異構酶;ispD:4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇合酶;ispE:4-二磷酸胞苷-2C-甲基-D-赤蘚糖醇激酶;ispF:2C-甲基-D-紅細胞-2,4-環二磷酸合酶;ispG:1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶;ispH:1-羥基-2-甲基-2(E)-丁烯基-4-二磷酸還原酶;idi:焦磷酸異戊烯異構酶;DXP:1-脫氧-D-酮糖-5-磷酸鹽;MEP:2-C-甲基-D-赤蘚糖醇4-磷酸;DPCME:4-二磷酸胞苷-2-甲基-D-赤蘚糖醇;DPCMEP:2-磷酸-4-二磷酸胞苷-2-甲基-D-赤蘚糖醇;MECDP:2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-2,4-環二磷酸;HMBDP:1-羥基-2-甲基丁烯基-4-二磷酸;AtIPK:來自擬南芥的異戊烯基激酶;ScCK:來自釀酒酵母的膽堿激酶;F8DT:異戊烯基轉移酶;IPP: 異戊烯基二磷酸;DMAPP:二甲基烯丙基二磷酸;IP:異戊烯基一磷酸;DMAP:一磷酸二甲基烯丙基。

針對上述問題,本文在EkF8DT游離表達的基礎上,引入IUP途徑,以提高DMAPP的供給;然后通過在線網站預測EkF8DT的結構,選取了8個位點進行截短,驗證了其對8-pk合成的影響;最后,通過在N端融合蛋白質標簽以及對質粒載體拷貝數、發酵溫度、異丙基-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-D-thiogalactoside,IPTG)濃度、誘導時機以及底物Kae的添加量優化,進一步提高8-pk的產量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質粒

EscherichiacoliJM109用于質粒構建與擴增。EscherichiacoliBL21(DE3)用于蛋白的表達。基因(EkF8DT,登錄號QXN66318.1;Scck,登錄號CP046092.1;Atipk,登錄號NP_173986.2)由上海生工合成。質粒表達載體由實驗室保藏。文中所使用的菌株列于表1。

表1 本實驗所使用的菌株和質粒

1.1.2 培養基

LB培養基(g/L):蛋白胨10、酵母粉5、NaCl 10。

搖瓶發酵培養基(TB+葡萄糖)(g/L):甘油5、蛋白胨12、酵母提取物24、KH2PO42.31、K2HPO416.37、葡萄糖10。

5 L發酵罐:種子液按照4%(體積分數)的接種量接種于含有2.5 L TB培養基的5 L發酵罐中。初始攪拌速度300 r/min,空氣流速2 vvm,溫度37 ℃。發酵10 h后,將補料培養基以5 mL/h的流速加入發酵罐中,共加入500 mL。用氨水調控pH為7,設置攪拌槳轉速300～600 r/min。補料培養基:500 g/L甘油。

1.2 實驗方法

1.2.1 質粒和菌株的構建

所有片段均由高保真DNA聚合酶擴增,使用上海生工即用型無縫克隆試劑盒進行質粒構建。用引物對pACYC-F/pACYC-R構建質粒pACYCDuet的線性化載體,用引物對IDI-F/IDI-R,并以E.coli基因組為模板,擴增idi基因片段,通過Gibson構建質粒pACYCDuet-F8DT-idi。其他質粒的構建方法同上。本試驗所用引物見表2。

表2 本實驗所引用的引物

1.2.2 培養條件

采用LB培養基培養種子液。用搖瓶發酵培養基發酵生產8-pk。挑取陽性轉化子于裝有5 mL LB(添加相應抗性)的50 mL搖瓶中,220 r/min、37 ℃培養8～12 h。將種子液按照2%(體積分數)的接種量接種于裝有25 mL搖瓶發酵培養基的250 mL搖瓶中,220 r/min,37 ℃培養,當OD600達到0.8～1時,加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG,溫度調至25 ℃,誘導10 h后加入終質量濃度為250 mg/L的Kae,繼續發酵36 h。

1.2.3 樣品處理及液相分析條件

發酵結束后,取500 μL發酵液于1.5 mL離心管中并加入同體積的甲醇,劇烈振蕩混勻后,12 000 r/min離心2 min,取上清液后用0.22 μm有機相濾膜過濾后使用島津LC-20AT高效液相色譜儀進行產物檢測。采用Thermo Fisher C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)進行色譜分離;柱溫箱溫度40 ℃;進樣量10 μL;流速1.0 mL/min。流動相分別為:A相為超純水(加入0.1%三氟乙酸),B相為乙腈(加入0.1%三氟乙酸);使用以下梯度實現分離:0～10 min(10%～40%B)、10～35 min(40%～80%B)、35～37 min(80%～10%B)、37～40 min(10%B)。在350 nm波長處檢測產物8-pk。

2 結果與分析

2.1 異戊烯醇利用途徑(IUP途徑)增加DMAPP的供給

將pACYCDuet-EkF8DT轉化至E.coliBL21(DE3),37 ℃培養至OD600為0.6～0.8時加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG,30 ℃、220 r/min誘導表達10 h后加入250 mg/L的Kae發酵60 h。然而,HPLC檢測發酵液顯示無8-pk的產生。推測可能的原因是異戊烯基前體供應不足,進行前體合成途徑強化的研究。如圖1所示,引入IUP途徑,表達釀酒酵母來源的Scck和擬南芥來源的Atipk,并且共表達E.coli內源的idi以促進IPP生成DMAPP。最終,在E.coliBL21(DE3)中表達構建的pACYCDuet-EkF8DT-idi-Scck-Atipk質粒,并在發酵過程中終濃度為25 mmol/L的3-甲基-3-丁烯-1-醇。以攜帶pACYC空質粒的E.coliBL21作為對照1,以僅引入Scck和Atipk,不過表達E.coli內源的idi,添加3-甲基-2-丁烯-1-醇作為對照2,以僅過表達E.coli內源的idi來強化MEP途徑作為對照3。如圖2所示,通過上述途徑構建策略,發酵36 h時,重組菌中8-pk產量最高可達到2.14 mg/L,而在對照1、對照2和對照3中均未檢測到8-pk。

圖2 引入IUP途徑菌株EI02生物合成8-pk的過程

上述結果表明,E.coliBL21本身無8-pk合成能力。實驗組能夠檢測到8-pk的原因可能是3-甲基-3-丁烯-1-醇作為底物時酶的kcat/Km要大于3-甲基-2-丁烯-1-醇[14],更好地增加了異戊烯基轉移酶的前體DMAPP在體內的合成量,進而產生更多的8-pk。而僅過表達E.coli內源的idi來強化MEP途徑不能夠為催化反應提供較多的DMAPP,因此推測DMAPP供應不足是8-pk合成的關鍵限制因素。

2.2 異戊烯基轉移酶的截短表達

根據http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/網站的預測結果顯示,EkF8DT是具有至少7個跨膜結構域的膜內源性蛋白(圖3-a)。膜蛋白的大量表達可能會對細胞膜產生損害,影響蛋白的可溶性表達[15],降低其催化活性甚至失活。而截短N端信號肽可以提高酶的催化活性[12]。將EkF8DT的氨基酸序列輸入TargetP 2.0在線工具,對EkF8DT的信號肽進行預測(圖3-b),峰的高度代表了信號肽的可能性。結果顯示EkF8DT的轉運肽在第49位氨基酸。并利用在線網站(https://drug.ai.tencent.com/)對蛋白質二級結構進行預測。結果顯示EkF8DT由10個α-螺旋的主體骨架和一個長側鏈組成。長側鏈的存在可能會對酶的結構造成影響。因此構建了8個N端氨基酸被截短的菌株,分別為截短40(EI04)、49(EI05)、56(EI06)、60(EI07)、64(EI08)、82(EI09)、96(EI10)和100(EI11)個氨基酸(圖4-a)。如圖4-b所示,菌株EI06、EI07和EI08可分別提高2、3和2.9倍的8-pk產量。菌株EI07的產量提高最明顯(6.46 mg/L)。可能是前60個氨基酸為定位信號肽,當其被截掉時,該酶無法定位到細胞膜上,同時酶的催化能力提高。菌株EI04、EI05、EI09和EI11在合成8-pk的能力上明顯下降。

a-跨膜結構域;b-信號肽

a-EkF8DT二級結構預測及截短位點;b-N端不同位點截短菌株發酵產量圖

2.3 蛋白質標簽改造異戊烯基轉移酶

添加蛋白溶解度標簽可提高外源蛋白的可溶性表達[16]。SUMO蛋白標簽融合到N端時,SAM表達菌株的可溶性蛋白表達量顯著提高[17]。LAI等[18]發現融合GST的蛋白在E.coliBL21(DE3)中的表達水平顯著提高。NusA標簽與乙醛脫氫酶融合,使得酶活性得到了提高[19]。因此我們選擇了GST、NusA和SUMO增強EkF8DT的可溶性表達。如圖5所示,菌株EI12的8-pk的產量較菌株EI07提高了2倍(12.92 mg/L)。而菌株EI17的產量是EI07的7.5%。結果證明SUMO標簽增強了重組蛋白的表達和溶解度[20],而NusA和GST標簽起到了負作用,這與之前的研究結果一致[21]。N端融合蛋白標簽能夠提高EkF8DT的催化能力,提高8-pk的產量,同時也證明蛋白質標簽的使用具有較強的選擇性。

圖5 N端連接不同的蛋白質標簽對8-pk生物合成的影響

使用抗性基因的前導序列作為助溶標簽能夠增強膜蛋白的表達,如在生產香葉醇的研究中,將Sm抗性基因的前25個前導序列和KANA的前34個前導序列融合到香葉醇合酶的N末端,前者使得香葉醇的產量提高了1.3倍,后者與對照組相比無明顯差異[22]。因此,將Sm和Kana的前導序列融合在EkF8DT的N端,測試結果發現菌株EI15和菌株EI16的8-pk產量為菌株EI07的97%和65%,證明該方法,無法有效提高EkF8DT的可溶性表達,降低了8-pk的合成。

2.4 質粒拷貝數對宿主細胞生長以及8-pk合成的影響

研究表明質粒拷貝數對宿主細胞生長以及產物合成有明顯影響[23]。通過更換不同拷貝數的質粒載體來驗證拷貝數對8-pk產量的影響。結果如圖6所示,替換為質粒載體pCDFDuet、pETDuet和pRSFDuet后,8-pk產量分別為pACYCDuet為質粒載體(EI12)的63%、62%和55%,OD600分別為原菌株(EI12)54%、200%和59%。

a-不同基因拷貝數質粒構建圖;b-不同拷貝數質粒菌株發酵產量圖

上述研究結果表明,質粒載體拷貝數對基因表達的影響較大,雖然中拷貝質粒載體pETDuet能夠使菌株菌體濃度得到較好提升,但是產量卻大幅度下降,說明產量與細胞生長不呈現正相關關系。可能是由于中高拷貝質粒使得EkF8DT被表達的速度過快,出現錯誤的折疊方式,導致EkF8DT可溶性降低。而低拷貝質粒載體pACYCDuet會降低基因復制速度,從而降低EkF8DT折疊時的錯誤率,提高EkF8DT的可溶性表達量。同時對于異戊烯基轉移酶膜蛋白來說,中高拷貝質粒載體使得其表達量增高,更易錨定于細胞膜上導致其活性降低,并影響菌株的生長,無法更好地行使其催化功能。

ZHANG等[24]研究發現Scck受質粒拷貝數的影響較為顯著,高拷貝的質粒pRSFDuet更適合該基因在大腸桿菌中的表達及應用,因此,將IUP途徑上的3個基因idi、Scck和Atipk共同構建到質粒載體pRSFDuet上,將其和pACYCDuet-SUMOEkF8DT60共同轉入E.coliBL21中,得到菌株EI20,結果顯示,8-pk產量僅3.60 mg/L。

2.5 8-pk合成過程的優化

在發酵過程中,誘導溫度是影響細胞生長和蛋白表達的重要因素,尤其是對膜蛋白來說,在較高溫度誘導表達,微生物生長速度較快,酶的合成速度也隨之較快,容易形成包涵體。反之,降低誘導溫度,有利于酶的正確折疊,但是細胞生長可能受影響。對菌株EI12進行發酵溫度優化,在不同的誘導溫度下(16、20、25、30 ℃)發酵36 h,檢驗8-pk產量,結果如圖7-a所示,在誘導溫度為25 ℃時,菌株EI12發酵生產8-pk的產量最高,為21.5 mg/L,是16、20和30 ℃發酵條件下8-pk產量的2.82、1.55和1.6倍。說明誘導EkF8DT表達的最適溫度為25 ℃。

a-誘導溫度;b-IPTG濃度;c-誘導時機;d-底物濃度

T7啟動子的表達系統利用IPTG誘導蛋白的表達,但較高濃度的IPTG對細胞生長有負面影響[25]。在250 mL搖瓶中培養菌株EI12至OD600=0.6～0.8時,分別加入終濃度為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mmol/L的IPTG,以測試不同IPTG濃度對發酵生產的影響。結果如圖7-b所示,當IPTG終濃度為0.20 mmol/L時,8-pk的積累量是當IPTG終濃度為0.05、0.10、0.15、0.25 mmol/L時的5.12、2.7、1.6、1.3倍。導致該結果的原因可能是低濃度的IPTG會導致誘導不完全,蛋白表達量不夠高,影響了8-pk的合成。而過高濃度的IPTG會使得轉錄和翻譯進行的較快,增加了蛋白折疊的錯誤率,催化能力降低,從而影響8-pk的合成。

將種子液按照2%(體積分數)的接種量接種于裝有25 mL搖瓶發酵培養基的250 mL搖瓶中,分別在OD600為0.3、0.6、0.9、1.2和1.5時加入終濃度為0.2 mmol/L的誘導劑IPTG,來驗證不同的誘導時機對8-pk合成的影響。結果如圖7-c所示,在OD600為0.9時加誘導劑8-pk的產量最高,為21.54 mg/L,是OD600為0.3、0.6、1.2、1.5時添加IPTG的3.9、1.4、1.2、1.9倍。

類黃酮使得E.coli的形態產生變化,損害細胞膜[26]。為確定最佳底物濃度,在添加IPTG 10 h后分別添加50、100、150、200、250 mg/L的Kae。結果如圖7-d所示,底物最適質量濃度為150 mg/L,8-pk產量進一步提高至24.28 mg/L。

2.6 5-L發酵罐發酵8-pk水平驗證

使用5 L發酵罐對生產菌株進行驗證,探究其合成8-pk的最大潛力。進行流加補料發酵,接種5 h后開始流加補料,補料速度為5 mL/h,共補料500 mL。在OD600=29時添加終濃度為0.2 mmol/L的IPTG,誘導8 h后添加終質量濃度為250 mg/L的Kae溶液和終濃度為25 mmol/L的3-甲基-3-丁烯-1-醇溶液。結果如圖8所示,發酵108 h后,8-pk的產量達到44.33 mg/L。

圖8 5 L發酵罐中EI12菌株生物合成8-pk的過程

3 討論

8-pk是一種具有高附加值的異戊烯基黃酮類化合物,其應用價值近年來逐漸被挖掘[27]。隨著國家雙碳戰略的提出,綠色生物合成在8-pk合成中展現出極好的應用前景。關于8-pk合成的相關文獻報道較少,植物來源的異戊烯基轉移酶至少存在7個跨膜結構域,使其難以進行可溶性表達,以及DMAPP供應不足,這都是限制8-pk產量提高的障礙。MEP途徑合成DMAPP有許多限制因素,例如G3P和丙酮酸供應的不平衡[28]和鐵硫酶IspG和IspH對氧敏感而容易失活等問題[29],且MEP途徑因需要輔因子的參與會與其他途徑競爭資源,這種復雜的調節使得該途徑提高DMAPP供應存在很多阻礙。因此,選擇引入代謝途徑更為簡短且高效的IUP途徑,可解決在E.coli中MEP途徑所生產的DMAPP供應不足的問題。針對異戊烯基轉移酶是膜蛋白具有定位信號肽的問題,我們采取了N端氨基酸截短的方式來解決。通過在線網站預測了信號肽位置和EkF8DT的二級結構,并根據預測的結構選取了8個代表性的位點進行截短。發現不同位置的截短會對8-pk合成產生不同效果,相比于根據預測信號肽的位置進行截短,根據AlphaFold2所預測的酶的二級結構進行截短具有更高的可信度。因此,根據酶的二級結構選擇位點截短并尋找規律,來細化截短的位置是最好的選擇。最后,通過融合表達蛋白質標簽、優化質粒拷貝數和優化發酵條件,8-pk在5 L發酵罐的產量達到44.33 mg/L,本研究為細菌中8-pk的高效生物合成提供了一定的參考。鑒于異戊烯基轉移酶具有較高的底物特異性,后期研究中通過篩選不同的酶,并結合本研究的策略可以有效地提高異戊烯基化的類黃酮類化合物的合成。