一氧化氮在牙周炎進展中的作用機制與應用

曲尼色珍,周延民

一氧化氮(nitric oxide,NO)是一種內源性合成的雙原子分子,具有自由基特性,存在于人體的各種組織和細胞中,參與調節多種生理和病理過程[1]。NO通常由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化L-精氨酸產生[2],其中NOS包括內皮型NOS(endothelial NOS,eNOS)、神經元型NOS(neuronal NOS,nNOS)和誘導型NOS(inducible NOS,iNOS)[3]。牙周炎作為常見的口腔疾病之一,其進展與牙周病原體引起的免疫炎癥反應相關[4],其中iNOS的表達使炎癥牙周組織中產生高濃度NO。本文將對NO在牙周炎進展及治療中的作用研究進行綜述。

1 NO在牙周組織中的表達

NO是免疫系統和循環系統發揮生理功能的重要調節劑,在人體內少量存在,其生成過多與細胞凋亡/死亡和組織損傷有關[5]。作為一種內皮源性信號因子,由eNOS和nNOS介導產生的低濃度NO在健康牙周組織血管擴張、神經信號傳遞、成骨細胞分化等生物過程中發揮信使/調節劑作用,并參與疼痛刺激的信號傳遞[6]。有研究表明,利用NOS抑制劑阻斷NO的生成可顯著抑制牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)成骨分化并刺激其分化為脂肪細胞[7],并進一步證明NO可能通過JNK/MAPK信號通路平衡PDLSCs向成骨細胞和脂肪細胞分化。

牙周炎癥反應過程中,病原體及其釋放的外毒素誘導巨噬細胞產生iNOS,催化底物L-精氨酸長時間產生大量NO,參與牙周炎的發生發展[8]。在牙周炎初期,菌群失調使大量中性粒細胞被招募至牙周組織,CD11b表達上調,同時iNOS等促炎因子表達顯著增多,高濃度NO作用于致病微生物及其產生的生物膜,發揮抗菌作用[9]。然而,長時間高濃度的NO會過度激活炎癥反應,并通過為細菌提供組織分解產物(如膠原蛋白肽和含血紅素化合物)等營養物質,引起炎癥和微生物菌群失調,兩者協同并產生正反饋回路[10],導致牙周上皮破壞和骨丟失。在炎癥消退階段,NO可抑制白細胞黏附血管內皮及中性粒細胞募集[11]。已有研究表明,與健康對照組相比,慢性牙周炎患者齦溝液及唾液中NO水平顯著升高[12-14],并且唾液NO水平隨著炎癥加重而增加。有學者發現,診斷為牙齦炎和牙周炎的患者在進行牙周治療后,唾液中NO水平降低;未經治療患者NO表達持續保持在較高水平[15]。因此,NO作為一種生物標志物,可用作檢驗牙周狀態的指標之一。目前已有學者研制出電化學傳感平臺及熒光探針,以實時監測和準確定量細胞內產生的NO,在牙周炎的早期診斷中極具潛力[16-17]。

2 NO促進牙周炎發展的作用機制

2.1 細胞毒性作用

牙周組織和唾液中的NO是口腔通過非特異性免疫抵抗病原體的一部分。iNOS完全依賴于炎癥刺激表達,一旦激活,iNOS會在數小時內產生持續高水平NO:一方面NO可以結合還原血紅素a3,與O2競爭,對細胞色素氧化酶產生抑制,同時其反應產物(包括過氧亞硝酸鹽、二氧化氮或亞硝基硫醇)可破壞線粒體結構的完整性,使線粒體通透性改變,從而導致巨噬細胞以及周圍的牙齦上皮細胞線粒體呼吸鏈受損,誘導細胞凋亡[18];另一方面NO與超氧化物反應形成的活性氮(reactive nitrogen species,RNS)和活性氧(reactive oxygen species,ROS)可通過脂質過氧化和脫氧核糖中嘌呤堿基、嘧啶堿基的化學改變等途徑造成細胞核酸、蛋白質和膜脂質損傷[19],從而抑制牙周病原體的增殖,減輕感染。但局部ROS和RNS產生過量可導致組織內氧化應激,造成結締組織破壞和牙槽骨吸收,繼而引起牙齒松動脫落[20]。

2.2 骨組織吸收

可溶性鳥苷酸環化酶(soluble guanylate cyclase, sGC)是NO受體,NO可激活sGC,促進環磷酸鳥苷(cGMP)產生[21-22],從而抑制破骨細胞黏附和酸分泌[23],并增加成骨細胞IL-6表達,促進成骨細胞分化[24]。生理條件下,NO誘導的sGC活化確保了骨吸收和骨形成之間的平衡;而在牙周炎癥狀態下,β1-sGC被氧化,sGC對NO的敏感度下降[25],從而抑制NO-環鳥苷單磷酸(cGMP)-蛋白激酶G(PKG)途徑[26],促進破骨細胞性骨吸收陷窩出現,成骨細胞活性受抑制,骨穩態破壞,并隨著牙周炎發展,導致牙槽骨吸收,牙齒松動移位,最終牙齒脫落,咀嚼功能下降。

2.3 軟組織破壞

軟組織降解主要是由纖維溶解酶和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)等宿主酶引起[27],NO可介導MMP的活化和表達。研究表明,NO的反應中間體過氧亞硝酸鹽和二氧化氮可激活中性粒細胞膠原酶(MMP-8),導致牙齦組織中膠原纖維在牙周炎早期嚴重流失[28]。成纖維細胞在結締組織更新和傷口愈合中起著關鍵作用,高濃度NO可抑制成纖維細胞活性,使膠原蛋白合成減少,可能引起愈合受損,導致組織破壞與組織修復的不平衡。這種失衡狀態下,牙周軟組織破壞增加,牙周膜基質及膠原纖維變性、降解,牙周膜間隙增寬,結合上皮向根方遷移,出現附著喪失形成牙周袋。

3 NO與牙周炎治療

NO與牙周炎密切相關,低水平NO參與信號轉導途徑并介導生理過程,可促進血管擴張、參與糖酵解途徑調節骨合成代謝,有助于牙周軟組織的修復與牙槽骨的重建[29],但高水平NO可產生細胞毒性,促進炎癥的進展[30]。近年來,眾多學者的研究熱點聚焦在NO雙向作用上,提出了截然不同的兩種治療策略。一種觀點認為可以通過遞送NO來實現抗菌抗炎作用[31],另一種則認為應通過抑制iNOS的產生從而降低NO濃度以阻斷炎癥的進展。

3.1 外源性NO遞送

目前,NO供體化合物主要包括硝酸酯類、偶氮二醇烯鎓鹽類(NONOates)、S-亞硝基硫醇類(RSNO/SNO)、呋咱氮氧化物類、NO-金屬配合物類等,通過水凝膠、微/納米顆粒、3D打印支架等載體進行外源性NO遞送[32]。供體釋放NO的持續時間是其發揮抗菌功效的主要決定因素。有研究證實,與瞬時NO濃度相比,供體釋放的細胞內總NO濃度對殺死牙周病原體更重要,瞬時NO濃度越低,NO總量越大,殺菌效果越好,細胞毒性作用越小[33]。低劑量NO與抗生素共同作用時,NO通過增加細菌磷酸二酯酶活性,減少細胞內第二信使和生物膜調節劑環二鳥苷單磷酸(c-di-GMP)水平,使細菌恢復浮游狀態,提高細菌對于抗生素的敏感性,從而有助于清除細菌生物膜。NO供體與抗生素聯合使用已被證明有助于克服與細菌生物膜相關的耐藥性[34-35]。但NO的物理性質常影響其在局部應用:①NO半衰期極短,為0.09～2 s(取決于O2和活性生物分子的局部濃度);②NO以“按需”方式合成,并容易通過磷脂膜擴散;③NO在其合成點附近發揮功能,通常迅速擴散,擴散范圍僅數百微米[36]。根據這些性質,目前已開發多種NO釋放方式,包括結合光活化、電荷切換或細菌靶向基團等,并通過在聚合物框架內封裝或偶聯NO供體來增加NO的儲存和遞送。Feura等[37]評估了釋放NO的羧甲基纖維素衍生物對浮游狀態牙齦卟啉單胞菌和伴放線聚集桿菌體外殺菌功效以及細胞毒性,發現這種釋放NO的聚合物濃度為4 g/L時,能夠在2 h內將兩種細菌活力降低99.9%,反映了NO的強效快速殺菌作用,該聚合物可作為針對牙周病原體的抗菌劑。此外有學者合成GNRs@mSiO2-SNO/ICG納米粒子[38],在808 nm的近紅外光照射下,金納米棒將光能轉化為熱能,SNO分子也會被熱激活,在牙周炎癥部位釋放NO,光動力、光熱療法以及氣體治療共同發揮抗菌作用,炎癥小體NLRP3和Caspase-1 mRNA表達急劇減少,進一步表明適當濃度的外源性NO遞送可以抑制促炎因子的表達。

3.2 抑制iNOS產生

與其他NOS不同,iNOS催化產生NO的效率最高,可以達到其他合酶的1 000倍,主要分布在巨噬細胞等免疫細胞中,參與炎癥性疾病的病理生理過程。在牙周炎中,iNOS水平與組織破壞的嚴重程度成正相關。因此通過調控iNOS活性進而抑制NO釋放以干預牙周炎的發展也是主流觀點之一。Kim等[39]從銅藻中分離出的天然產物Epiloliolide通過下調牙齦卟啉單胞菌脂多糖激活的NLRP3,抑制了iNOS的表達,降低局部NO濃度,低濃度NO可有效促進人牙周膜細胞的增殖和遷移。有研究表明亞硒酸鈉和α-生育酚的聯合應用可以顯著抑制牙周炎的進展,其中亞硒酸鈉通過抑制NF-κB表達來減少iNOS,從而減輕硝化應激造成的牙周組織損傷,同時牙齦組織中CD95的表達受到抑制,CD95作為外源性細胞凋亡途徑的重要受體,可能參與牙周病的發病機制[40]。利特庫巴寧A(LA)是一種新型異喹啉生物堿[41],LA可以通過NF-κB途徑顯著抑制脂多糖誘導的炎性巨噬細胞活化,降低iNOS等炎癥因子表達。此外,分子模擬對接表明活性LA通過來自N→O基團的電荷與iNOS的GLU 371殘基產生相互作用,直接與iNOS蛋白結合,抑制巨噬細胞NO表達,減少NO合成,從而抑制牙周炎進展。一氧化碳也可以作為牙周病的宿主反應調節劑,通過抑制iNOS等促炎因子表達,從而有助于防治牙周病[42]。

4 總結與展望

綜上所述,NO在牙周炎進展中具有雙重作用。作為一種脂溶性的氣體小分子,NO在生理情況下有助于牙齦疼痛的感知、保護組織免受感染,維持牙齦循環的內穩態;病理情況下,菌斑微生物激活iNOS,釋放高濃度NO促進細菌裂解、炎癥發展及組織破壞。但NO在口腔組織和口腔疾病中的作用機制、雙向作用的濃度閾值尚需進一步研究。目前研究證明,在合適的濃度閾值之內,外源性NO的遞送有助于抑制牙周病原體的繁殖,介導菌斑生物膜的清除,有助于治療牙周炎。但當局部NO濃度過高時,抑制iNOS產生進而減少NO產生也可以作為減緩牙周炎發展的有效方法。此外,NO作為一種生物標志物,應用潛力較大,在疾病進展的早期診斷中起著重要作用。隨著科技的發展,對牙周組織內中NO的定位定量檢測將成為現實,屆時可以根據局部NO的濃度實現牙周炎早期診斷、及時治療的目標,以達到延緩炎癥進展,促進組織再生目的。