雞肝臟中能量代謝相關膜蛋白基因及其上游轉錄因子的篩選與鑒定

申 杰，李 剛，黃 濤，皮勁松，龔炎長，潘愛鑾，吳 艷，張 昊，付 明，梁振華

（1.湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所/湖北省農業科技創新中心/動物胚胎與分子育種湖北省重點實驗室，武漢 430064；2.湖北農墾對外經濟交流中心，武漢 430064；3.華中農業大學農業動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室，武漢 430064）

雞肝臟在能量代謝、消化和免疫方面發揮著多種作用，易受到氧化應激，如急性熱應激和空腹應激［1-4］，直接影響其生產性能。跨脂質分子層膜蛋白（Tran membrane protein，TMEMs）代表一類橫跨脂質雙分子層的膜蛋白［5］，可以在各種細胞膜上擴散，包括線粒體、內質網、溶酶體和高爾基體膜，并控制特定物質在生物膜上的運輸。因此，TMEMs參與細胞的生理生化過程，對細胞功能的維持具有重要作用。

近年來，研究發現TMEMs可作為癌癥生物標 志 物（如TMEM45A、TMEM116、TMEM207和TMEM213）［6］，也可作為抑癌基因（如TMEM25和TMEM7）［7，8］，還可作為促癌基因（如TMEM158和TMEM14A）［9，10］。TMEMs在 腫瘤 研 究領 域 相對 較多，且具有重要功能。本研究利用前期雞肝臟轉錄組數據［11］，挑選了8個TMEMs基因，檢測其在肝臟中的表達變化，預測及鑒定其上游轉錄因子。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

將海蘭褐隨機分為限飼組（n=10）和自由采食組（n=10）。對于限飼組，每只雞每天投料量40～50 g，而對于自由采食組，料槽不斷料。飼養的肉仔雞和蛋仔雞在6周齡時處死，采集肝臟組織保存。

1.2 總RNA的提取與反轉錄

使用TRIzol試 劑（Invitrogen公司，Carlsbad，CA）提取總RNA。通過ND-2000型分光光度計（Nano-Drop公司）和1%瓊脂糖凝膠電泳評估RNA濃度和純度。使用Prime Script RTReagent Kit（寶日醫生物技術（北京）有限公司）反轉錄，1μg總RNA與1.0μL gDNA Eraser和2μL 5×gDNA Eraser緩沖液混合，42℃孵育2 min，以消除基因組DNA。將1μL Prime Script RT酶混合物、4μL 5×Prime Script緩沖液、1μL RT引物混合物和4μL Raze-free水加到混合物中，37℃保溫15 min，85℃保溫5 s，然后4℃終止反應。cDNA產物保存于-20℃。

1.3 RT-qPCR

在Bio-Rad CFX96系統（美國Bio-Rad公司）上使用SuperReal PreMix（SYBR Green）（天根生化科技（北京）有限公司）分析基因的表達水平，所設計引物見表1。每個樣品3個重復，以雞GAPDH基因為參照，使用2-ΔΔCT方法計算表達量。

表1 RT-qPCR檢測的引物序列

1.4 細胞的培養

雞胚原代肝細胞的分離與培養參照文獻［12，13］。孵育15 d的雞胚30個，取出肝臟并切碎，用1×PBS溶液洗滌，然后用膠原酶IV（BIOFROX公司）在37℃消化20 min。100目和500目篩過濾細胞，室溫下800 r/min離心5 min，每次過濾后用1×PBS溶液洗滌3次。在細胞中添加10%胎牛血清（FBS）（AusGeneX公司）和1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養基。將細胞密度調整為5×105個/mL，細胞鋪板后，37℃下5%CO2培養。

DF1細胞在添加10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的DMEM中培養，在37℃下5%CO2孵育。

1.5 質粒的構建與轉染

利用Q5高保真DNA聚合酶擴增TMEM86A啟動子區（NC_006092.4）不同長度DNA片段（P1-P5），分別插入熒光素酶報告載體pGL3-BasicNheⅠ和XhoⅠ酶切位點。將ARNT（NM_204200.1）、CREB1（NM_204450.2）和SP1（NM_204604.1）基因的編碼序列分別克隆到pcDNA3.1載體中，重組載體引物見表2。使用LipofectamineTM3000（Invitrogen公司）對細胞進行瞬時轉染。對于24孔板（2.5×105個/孔）培養的細胞，在LipofectamineTM3000中，加入熒光素酶報告質粒500 ng、pcDNA3.1重組質粒500 ng和pRLTK質粒50 ng轉染細胞。處理48 h后，使用雙熒光素酶報告系統檢測熒光比值。所有結果均來自至少3次獨立試驗。

表2 用于重組載體構建的引物序列

2 結果與分析

2.1 TMEMs基因在肝臟中的表達

選取8個TMEMs基因，分別檢測在蛋雞和肉雞肝臟中的表達水平。由圖1可知，TMEM45A、TMEM51、TMEM86A、TMEM97和TMEM154基因在肉雞中的表達量顯著（P＜0.05）高于蛋雞，表明2種類型雞的肝臟內細胞代謝狀態存在差異。此外，為比較相同品種的不同采食方式對TMEMs基因的表達影響，設置了自由采食組和限飼組，檢測結果見圖2。與自由采食組相比，限飼組肝臟TMEM135、TMEM199和TMEM214表達水平顯著下調（P＜0.05）。與自由采食組相比，限飼組只有TMEM86A基因表達水平顯著升高（P＜0.05），提示饑餓狀態可能是導致TMEM86A基因上調表達的原因。

圖1 TMEMs基因在蛋雞和肉雞肝臟中表達水平

圖2 TMEMs基因在自由采食組和限飼組肝臟中的表達水平

2.2 TMEM86A基因啟動子區調控區域的鑒定

將雞TMEM86A基因轉錄起始位點作為+1，將其5′側啟動子序列作為調控區域進行PCR擴增，并截短為5個片段構建pGL3重組載體。在雞胚肝臟細胞中，熒光素酶報告基因試驗結果顯示pGL3-P5到pGL3-P3的熒光素酶活性相對穩定，當截短到pGL3-P2時，其熒光素酶活性明顯下降，表明-906 bp至-615 bp之間的序列中存在重要轉錄因子；當再次截短后pGL3-P1的熒光素酶活性上升，表明在-615 bp至-296 bp之間的序列中存在抑制性的轉錄因子。推測TMEM86A基因的啟動子受多種轉錄因子調控（圖3）。

圖3 熒光素酶報告基因試驗檢測TMEM86A基因啟動子活性

2.3 靶向TMEM86A基因轉錄因子的篩選與驗證

根據Jaspar和TRANSFAC軟件的結果，預測7個靶向TMEM86A啟動子的轉錄因子，分別為SP1、CREB1、E2H4、EGR1、ASCL1、HIF1A和ARNT。通過RT-qPCR檢測轉錄因子在自由采食組和限飼組之間的表達水平，表明SP1、CREB1和ARNT在兩組中表達存在差異（圖4）。限飼處理促進了SP1和ARNT的表達，抑制了CREB1 mRNA的表達。在DF1細胞中利用雙熒光素酶報告基因系統分析轉錄因子對TMEM86A基因表達活性的影響，結合超表達轉錄因子和共轉染pGL3-P5試驗，發現SP1顯著促進pGL3-P5熒光素酶活性（圖5a），CREB1顯著促進pGL3-P5的相對熒光素酶活性（圖5b），但ARNT對pGL3-P5熒光素酶活性變化不顯著（圖5c）。

圖4 預測轉錄因子在限飼組與自由采食組間的mRNA表達

圖5 超表達SP1、CREB1和ARNT檢測p GL3-P5片段的熒光活性

3 小結與討論

本研究從TMEMs基因在雞肝臟中的表達檢測結果中，發現限飼處理會促進TMEM86A基因上調表達，提示該基因可能參與饑餓應激。給小鼠喂食高脂肪食物可以降低脂肪組織溶酶漿原水平，并增加跨膜蛋白TMEM86A含量，當TMEM86A基因被敲除以后，線粒體氧化代謝增強，能量消耗提高，表明其是參與能量代謝的重要基因［14］。蛋雞在日常生產過程中，經常因為喂料不均、過少造成能量攝入不足，從而導致長時間停產或減產，因此探究TMEM86A基因的生物功能具有重要意義。

根據TMEM86A基因上游序列，使用Jaspar網站和TRANSFAC網站預測了7個潛在轉錄因子，在自由采食組和限飼組中RT-qPCR結果顯示，ARNT、SP1和CREB1 3個轉錄因子存在差異表達。CREB通過調節哺乳動物中的糖原和脂質代謝，在脂肪組織和肝臟中發揮著至關重要的作用［15］。與生長緩慢的雞相比，生長迅速的雞肝臟中CREB1 mRNA和蛋白表達水平顯著（P＜0.05）升高［16］，高脂肪飼料喂養的雄性大鼠肝臟中CREB1表達上調［17］。限飼組肝臟中CREB1的表達下調，CREB1通過靶向TMEM86A基因的啟動子，調控TMEM86AmRNA的表達水平。除了CREB1，發現SP1能影響TMEM86A的啟動子活性，轉錄因子SP1在多種組織中廣泛表達，在細胞黏附、侵襲、遷移和血管生成中發揮重要作用［18］。本研究表明在肝臟細胞中SP1和CREB1通過靶向TMEM86A基因，共同參與雞肝臟的能量代謝過程。